Nat Commun：新一代抗癌细胞疗法出炉！将红细胞改造为人工抗原呈递细胞，有潜力治疗一系列癌症

2021年5月21日讯/生物谷BIOON/---T细胞通过T细胞受体（TCR）对癌症抗原的特异性识别，在抗癌免疫中发挥了关键作用。近年来，旨在操纵或模拟T细胞反应的方法（如免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T[CAR-T]细胞）已成为抗癌治疗的一个重要焦点。然而，与这些治疗相关的局限性（包括致命的不良反应和某些情况下的抵抗性产生），以及自体CAR-T细胞所需的复杂和昂贵的个性化生产过程，促使人们继续研究刺激T细胞介导的抗肿瘤反应的其他方法。

有效的T细胞激活需要三个不同的信号：与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合的肽与TCR接合（信号1）；促进T细胞激活、功能和生存的共刺激信号（信号2）；以及促进T细胞进一步扩增和分化、增强效应功能和形成免疫记忆的细胞因子信号（信号3）。信号1和2通常由抗原呈递细胞（APC）传递。树突细胞或利用成纤维细胞、微珠、生物可降解聚合物和K562细胞的人工APC（artificial APC, aAPC）平台已作为体内或体外刺激T细胞的抗癌治疗药物进行研究。

红细胞（RBC）具有独特的特性，使其在异体细胞治疗中具有吸引力，包括使用O型阴性献血者血液时的固有生物相容性。这导致了它们在输血医学中的长期使用，副作用非常少。此外，红细胞与多种可以保护它们免受抑制性或不利的宿主反应的免疫豁免（immune privilege）机制有关。从生产的角度来看，造血祖细胞的体外培养和分化可以使红系细胞（erythroid cell）扩增许多倍。此外，通过基因改造，有可能产生表达生物治疗蛋白的工程化人类红细胞，比如RCT™（Red Cell Therapeutics™）。由于红细胞前体细胞去核，所表达的蛋白得以保持，但是对造血祖细胞进行的基因修饰不能被携带到患者使用的最终产品中。最后，鉴于红细胞被限制在大多数实质器官和脾脏的血管中，它们有可能避免循环免疫调节蛋白的一些靶向毒性。

在一项新的研究中，美国研究人员描述了他们的异体RCT-aAPC平台的开发、表征和临床前测试。该平台含有与I型MHC（MHC-I）分子结合的肿瘤特异性肽、共刺激配体（4-1BBL）和称为IL-12的细胞因子信号。相关研究结果于2021年5月11日在线发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“Engineered red blood cells as an off-the-shelf allogeneic anti-tumor therapeutic”。

这些作者在体外和体内证实这种RCT-aAPC能够驱动抗原特异性的T细胞扩增和获得效应功能，并且在临床前小鼠模型中能够控制肿瘤。重要的是，肿瘤控制与长期记忆的产生和表位扩展（epitope spreading）有关，从而实现抵抗不表达原始靶抗原但其他方面相同的肿瘤的疗效。这些功能导致了一种临床候选药物RTX™-321的诞生，它表达与HLA-A*02:01结合的人乳头瘤病毒（HPV）16 型E7肽11-19（HLA-A2-HPV）、4-1BBL和IL-12。他们发现，RTX-321能诱导HPV抗原特异性原代人类T细胞的激活，而且所有这三种信号都足以实现强大的效应功能和效应记忆细胞的分化。鉴于一些复发性HPV阳性癌症的生存率很低，这项研究表明RTX-321代表了一种有前景的策略，可用于多种肿瘤类型的临床研究。

值得注意的是，RTX-321使HPV特异性的原代人T细胞在体外扩增成为可能，这突出了该平台的潜在治疗应用。这种方法被设计成通过在人类去核红细胞的细胞表面呈现数千个拷贝的生物治疗蛋白来模拟人类免疫生物学，因此不同于其他利用合成受体（如用于CAR-T细胞）的方法，非异体细胞系进行离体T细胞扩增，或合成平台（如脂质体或可生物降解聚合物颗粒）。

除了装载肿瘤抗原的MHC I（信号1）外，这些作者使用4-1BBL作为T细胞的共刺激配体（信号2）。4-1BBL与T细胞上的4-1BB的结合促进了T细胞的生存和增殖，增强了效应功能，对免疫记忆的形成至关重要。在CAR-T细胞的临床试验中，与使用CD28结构域相比，纳入4-1BB共刺激结构域有利于中央记忆T细胞（TCM）的产生和更长的T细胞持久性。

这些作者确定纳入作为细胞因子的IL-12（信号3），通过促进抗原特异性T细胞的扩增、记忆和效应功能以及肿瘤控制，达到最佳效果。这与IL-12作为一种强有力的促炎性细胞因子，诱导NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞释放IFNγ的已知功能相一致。此外，IL-12通过STAT4的信号转导对Th1细胞分化和CD8+T细胞的细胞毒性活性至关重要。

这些作者证实T细胞的扩增和激活与两种小鼠肿瘤模型中的肿瘤消退和治愈有关。这些作者利用点击化学将重组蛋白偶联到小鼠RBC上，构建出含有膜结合4-1BBL 和IL-12的mRBC-aAPC作为RCT-aAPC的替代物。他们的数据显示，mRBC-aAPC不仅可以驱动对外来抗原OVA的抗肿瘤反应，而且可以驱动对自然表达的肿瘤抗原gp100的抗肿瘤反应。与长肽联合弗氏不完全佐剂（长肽+IFA）的疫苗接种相比，mRBC-aAPC治疗提供了优越的生存效益。长肽+IFA是在针对单个T细胞表位的HPV 16+癌症临床开发中走得最远的疫苗接种平台，因此被用作与其他平台（DNA疫苗、基于蛋白的疫苗和病毒/细菌载体疫苗）相比的比较对象。他们的结果表明，mRBC-aAPC提供了疫苗和佐剂可能无法提供的额外治疗效果。

此外，与抗PD-1治疗相比，用mRBC-aAPC治疗促进了对肿瘤控制的改善，而抗PD-1治疗在B16-F10肿瘤模型中的效果是最小的。有趣的是，静脉注射的mRBC-aAPC似乎被限制在脾脏的血液循环和开放血管中，在那里它们与抗原特异性T细胞发生相互作用，并能够有效地诱导抗肿瘤反应。事实上，近期的数据提示着脾脏是对免疫疗法有反应的细胞的一个重要来源。

mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12耐受性良好，并优先分布于脾脏以促进T细胞相互作用，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-22898-3。

尽管显示了初步的疗效，但IL-12和4-1BB激动剂抗体在临床试验中已经证实会引起肝脏毒性和其他毒性。这部分是由于诱导免疫激活的多效性以严重的在靶非组织毒性（on-target, off-tissue toxicities，即脱靶毒性）为代价，这促使人们尝试将治疗性免疫调节蛋白限制在肿瘤微环境中，尽量减少全身暴露。这些作者开发的mRBC-aAPC保持了良好的安全性，表现在小鼠体重没有明显变化，脾脏肿大、肝脏炎症、ALT升高和IFNγ水平发生微小可逆变化。这可能是由于mRBC-aAPC在血管和脾脏的生物分布以及4-1BBL和IL-12的膜结合性质，这限制了它们的潜在脱靶毒性。

重要的是，EG7.OVA模型中治愈的小鼠不仅对EG7.OVA肿瘤细胞的再次挑战有抵抗力，而且对缺乏OVA（信号1）的亲本EL4细胞系的挑战也有抵抗力，这表明记忆的形成和表位扩展；这已被证明可以改善接受癌症免疫治疗的患者的预后。虽然表位扩展以前已被证明是通过采用预先激活的或经过基因修饰的T细胞的过继性转移来实现的，但是在这项新的研究中，这些作者发现设计成人工APC的RBC可以通过幼稚T细胞（naïve T-cell）转移促进体内的表位扩展。鉴于使用单一的肿瘤抗原可能被认为是这种方法的潜在限制，这是这项新的研究中的一个特别有希望的发现。例如，最近针对靶向CD19的免疫疗法的研究数据已提示着，一部分疾病复发的患者发生肿瘤细胞表面上的CD19缺失。然而，这些作者的数据表明，mRBC-aAPC不仅能驱动抗原特异性T细胞的激活和扩增，还能促进肿瘤微环境的变化，包括内源性T细胞的增加，Treg细胞数量的减少，增殖性Th1细胞的增加，以及M1巨噬细胞的增加。这些变化可能有助于抗原扩展（antigen spreading），以及在用缺乏靶抗原的肿瘤细胞重新挑战的动物中观察到的相关保护。此外，广泛的免疫激活可能有助于导致比长肽疫苗接种更高的有效性。

HPV+癌症患者的血液循环中存在不同频率的HPV抗原特异性T细胞。这些作者在OT-1细胞（它们经过基因修饰后表达一种能够识别与小鼠MHC-I分子H-2Kb结合的OVA肽的受体）过继性转移的存在或不存在下模拟患者中的抗原特异性T细胞频率范围。在抗原特异性T细胞频率较高（即进行OT-1细胞过继性转移）的情况下，提供所有三个信号的mRBC-aAPC（即mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12）比缺乏信号1的mRBC-aAPC（即mRBC-4-1BBL-IL-12）更有效。然而，在抗原特异性T细胞频率较低（即没有进行OT-1细胞过继性转移）的情况下，他们观察到mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-4-1BBL-IL-12的疗效类似。这表明，在没有OT-1细胞过继性转移的模型中，抗肿瘤作用的主要驱动力是mRBC-aAPC的4-1BBL和IL-12成分。尽管提供信号1导致靶抗原特异性T细胞更早的扩张，但这并没有转化为对肿瘤生长的额外影响。因此，这些数据表明，这些信号在临床上的相对重要性可能由患者体内预先存在的靶抗原特异性T细胞的数量决定。

mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12促进免疫记忆和表位扩展，并利用内源性T细胞，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-22898-3。

尽管有现有的治疗方案，但在治疗HPV+癌症方面仍有很高的需求没有得到满足，而且复发性疾病患者的生存率仍然很低。这促使这些作者开发了一种靶向HPV特异性抗原的RCT-aAPC（RTX-321），用于潜在的治疗应用。众所周知，HPV的病毒性癌蛋白E7通过破坏pRB肿瘤抑制因子的活性来推动众多癌症的产生。来自HPV16的E711-19肽被选择用于RTX-321是因为它来自这种癌蛋白的一个不变区域，该肽可诱导细胞毒性T淋巴细胞激活，并且由HLA-A*02:01（美国人口中最常见的HLA等位基因）呈递。他们发现，RTX-321诱导TCR信号转导，导致HPV抗原特异性T细胞的扩增，促进效应功能，诱导效应记忆细胞群体的扩增，并建立TCM细胞库，这表明RTX-321治疗可能导致持续的抗肿瘤反应。

这项新的研究提出了一种用于治疗癌症的基于基因工程RBC的aAPC平台，并显示了这种方法在原代人类细胞中的效果。RBC已经在输血医学中使用了几十年，O型阴性献血者的血液可以可靠地输给大多数人。异体工程RBC可以在多个患者中使用，并使用可扩展的制造工艺生产，而不需要TCR-T细胞疗法和CAR-T疗法中使用的复杂、个性化的生产过程。RCT-aAPC平台展示了广泛的抗原适用性，旨在模仿T细胞-APC相互作用的生物学特性，可能作为免疫疗法用于治疗一系列癌症。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Xuqing Zhang et al. Engineered red blood cells as an off-the-shelf allogeneic anti-tumor therapeutic. Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-22898-3.