Nat Commun：鉴定出CAR-T细胞治疗胰腺癌的潜在靶标

2021年4月27日讯/生物谷BIOON/---胰腺癌是一种毁灭性的疾病。在过去的几十年里，这种癌症的5年总生存率仍然不足5%，未发生较大变化，目前它是西方国家癌症相关死亡的第四大原因。手术仍然是唯一有可能治愈这种癌症的方法，但只有约20%的患者在诊断时处于手术可切除的疾病阶段。在最先进的治疗方法下，手术可切除的患者的中位总生存期为26个月，然而已发生转移的患者的中位总生存期为不到6个月。因此，对新治疗方案的需求尚未得到满足。嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）是一种新的有前途的治疗方法。对胰腺导管腺癌（PDAC）进行有效细胞免疫治疗的一个主要障碍是缺乏合适的肿瘤特异性抗原。

在一项新的研究中，德国研究人员进行了经验性筛选旨在发现治疗PDAC的CAR候选靶标，确定了四个候选靶标：CLA、TSPAN8、CD66c和CD318。他们发现CLA在上皮性肿瘤上表达。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“Identification of CD318, TSPAN8 and CD66c as target candidates for CAR T cell based immunotherapy of pancreatic adenocarcinoma”。

到目前为止，CLA只被认为是一种独特的皮肤归巢受体，在T细胞、B细胞、NK细胞、朗格汉斯细胞、单核细胞和树突状细胞的亚群中表达。它是SELPLG蛋白的一种特殊的糖基化形式，通过与E-选择素、L-选择素和P-选择素结合在免疫细胞的组织浸润中起作用。由于它只在这些细胞类型的亚群上表达，这些作者推测它可能是一个合适的CAR-T细胞靶标，具有可接受的肿瘤外毒性。然而，由于它的表达在活化的T细胞上发生上调，它构成了产生功能性CAR-T细胞的一个技术障碍。CLA特异性CAR-T细胞的表现更差，这凸显了CAR-T细胞对自身抗原特异性的内在问题。科学家们为这个问题开发了潜在的解决方案。一些人建议用CRISPR/Cas介导的方法敲除T细胞内的抗原，另一些人则主张利用内质网滞留结构域与自身抗原特异性的scFv结合，将自身抗原捕获到T细胞中。

其他确定的候选靶标CD66c、CD318和TSPAN8已被描述为在一些癌症实体中过度表达。结合这些作者的抗体驱动的筛选、全面的生物信息学分析和免疫荧光分析，他们增加一个重要的知识，即这些候选靶标的表达不仅在PDAC肿瘤细胞中高度富集，而且在人体中的肿瘤外表达也受到限制。这种方法的有效性的一个强有力的支持是，他们确定了已经用于CAR-T细胞治疗的靶标，如CEACAM5（CEA）或PROM1（CD133）。

鉴定PDAC CAR候选靶标，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-21774-4。

这些作者在体外评估了32种在scFv定位和间隔区长度上存在差异的CAR构建体。对CD318和CD66c而言，较短的间隔区显示出最高的功能性，而基于较长间隔区的TSPAN8特异性CAR构建体表现更好。CD318具有最长的细胞外氨基酸链（638），其次是CD66c（320）和TSPAN8（24和96）。尽管对scFvs的确切表位和细胞外结构域的三维结构缺乏了解，但是这些发现很好地与以前的调查相吻合，指出较长的间隔区对膜近端表位有优势，反之亦然。

此外，这些作者发现，在两个独立的临床前研究中，他们的四种体外表现最好的CAR构建体也表现出了抗肿瘤的功效。CD318 XS Vh-Vl CAR和TSPAN8 S Vh-Vl CAR被证实是非常有前途的候选CAR，基于它们的高效力，可以进一步进行临床前评估和潜在的临床评估。在两种异种移植模型的一种中，CD66c S Vl-Vh CAR在体外疗效方面要落后些，但仍能诱导疾病稳定。

这些作者发现CD66c特异性CAR-T细胞的活性下降不是由于靶标下调引起的，而且脾脏中的CAR-T细胞数量与其他治疗组无关，因此排除了持久性这个问题。在肿瘤部位，他们发现巨噬细胞和CAR-T细胞的浸润减少，这表明CAR-T细胞的浸润和潜在激活可能受到损害。其他研究已表明，抗原非依赖性信号转导（tonic signaling）可导致体外和体内研究中的这种差异。然而，他们没有观察到与靶标阴性细胞共培养的CAR-T细胞的背景激活。当改用基于CD66c XS的CAR构建体时，他们发现这种CAR构建体在体内的表现更出色，尽管在体外只观察到微小的差异。一个主要的区别是就XS构建体而言，IL-2和其他细胞因子的释放更出色。据观察，IL-2的产生表明有一种适当的功能性共刺激结构域。此外，IL-2在实现共刺激信号对T细胞生存、增殖和体内持久性的积极作用中起着关键作用。

在可能的临床转化方面，这些作者发现CD66c和CEA的重叠表达，使其成为一个有趣的候选靶标。事实上，已经证明CD66c比CEA在恶性组织中更多地过度表达。这一发现可能有助于制造微调的CAR，以便能够区分肿瘤细胞和健康细胞的不同表达水平。然而，CD66c在中性粒细胞和其他髓样细胞上的表达水平凸显了通过血液中大量的CAR-T细胞反应性诱发严重的细胞因子释放综合征（CRS）的风险，这在用CD19特异性CAR-T细胞治疗的B-ALL患者中观察到，特别是在肿瘤负荷高的患者中。

然而，虽然CRS和B细胞增生可以得到很好的治疗，但中性粒细胞减少只能在一个很短的时间窗口内被容忍，这使得CD66c成为一种高风险的靶标，至少在单靶标特异性的CAR-T细胞方法中是如此。使用布尔逻辑门控（比如AND或NOT CAR构建体）的组合方法可能会提供一个替代方案来规避预期的毒性。这些作者发现与CD318的组合可能是他们的候选靶标中的最佳选择。在这方面，已有的靶标（如MSN或CD133）和这项研究描述的靶标的组合，也将扩大特异性靶向胰腺肿瘤细胞的CAR库。进一步的替代选择是开发区分肿瘤细胞和健康细胞表面上抗原表达水平的CAR，或者严格控制结合物的给药时间和剂量的CAR，如抗FITC引导的CAR或UNI-CAR。此外，对CAR表达或激活进行空间控制可能进一步增加安全性。这些方法有可能克服在单一靶标特异性CAR-T细胞中观察到的在靶肿瘤外毒性（on-target off-tumor toxicities，即脱靶毒性）。

CD318和TSPAN8已被提出作为药物疗法或抗体驱动疗法的靶标。虽然之前的研究已显示体外和体内的肿瘤增长率下降或疾病稳定，但这些作者的结果显示肿瘤被完全根除，这很可能归于代表“活体药物”的T细胞的卓越细胞毒性。在B细胞恶性肿瘤中，这一点已被证明，即在先前的CD19特异性抗体治疗失败后，通过CD19特异性CAR-T细胞的施用实现了疾病的完全缓解。然而，由于CAR-T细胞比抗体更有效，而且其药代动力学难以预测和控制，因此必须谨慎管理，以应对潜在的肿瘤外毒性。他们旨在预测组织面临风险的分析表明，CD318具有最有利的模式，在健康组织中几乎没有检测到这种蛋白的表达。根据他们的结果，预测TSPAN8特异性毒性的最高风险发生在胃肠道，特别是结肠，可能与靶向CEA的CAR所观察到的相似。与CEA类似，使用另一种CAR-T细胞输注途径进入肝动脉可能是克服这种潜在健康威胁的一个解决方案。此外，使用AND CAR策略有可能进一步减少对结肠组织的毒性，CAR-T细胞只有在遇到CD318和TSPAN8时才被激活。

当然，除了安全性之外，疗效也必须在临床上得到证明。这些作者发现，只有靶标阳性的肿瘤细胞才能诱导T细胞激活。这些候选靶标在人源肿瘤异种移植模型和原发性PDAC上偶尔表现出不同的表达模式，这可能反映了PDAC的不同遗传背景。然而，这与以前的PDAC CAR靶标无关。这就提出了对预测疗效的配套诊断工具的需求。最有可能的是，在患者活组织检测中测得的靶标表达将在这种高度个性化方法的未来发挥核心作用，这篇论文描述的循环免疫荧光（cyclic Immunofluorescence）方法可以帮助对患者进行分层。

在靶向CD19的CAR疗法中，尽管最初检测到靶标表达下调或丢失，但仍可能导致疾病复发。肿瘤通过抗原逃逸产生治疗抵抗性的风险取决于靶分子的生物学功能，它决定了肿瘤独立于靶分子的难易程度。在这项新的研究中，这些作者没有直接分析靶细胞丢失作为一种抵抗性机制的概率，尽管他们在体内模型中没有观察到这种效应。然而，由于与人类肿瘤治疗相比，小鼠实验的时间跨度有限，这可能会被忽略，就像CD19的情况一样。以前的大量研证实了CD66c、CD318和TSPAN8对癌症的侵袭性和传播起着关键作用。然而，它们是否对肿瘤细胞的生存至关重要，特别是对PDAC而言，仍然不清楚。这进一步强调了多靶标可用性的必要性，允许联合治疗，从而通过增加对肿瘤细胞的选择性压力来减少靶标阴性疾病复发（target-negative relapse）的风险。

对CAR-T细胞的体外靶标特异性激活和对CD66c XS CAR进行体内评价，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-21774-4。

总之，这项研究将基于经验的抗体流式细胞仪筛选与循环免疫荧光成像平台相结合，并对肿瘤外表达进行了全面的生物信息学和实验评估，以确定PDAC特异性细胞表面标志物。这些作者确定了四个候选靶标，即CLA、CD66c、CD318和TSPAN8，以便通过CAR-T细胞对PDAC进行可能的细胞免疫治疗。CD66c特异性CAR、CD318特异性CAR和TSPAN8特异性CAR在体外和体内都显示出功能，其中CD318是最有利于临床转化的候选靶标。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Daniel Schäfer et al. Identification of CD318, TSPAN8 and CD66c as target candidates for CAR T cell based immunotherapy of pancreatic adenocarcinoma. Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-21774-4.