基因编辑技术治疗唐氏综合征的研究进展及其前景展望

2022年3月30日讯/生物谷BIOON/---基因编辑（gene editing）是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因或者它们的转录本进行修饰的一种基因工程技术。它能够让人类对目标基因或它们的转录本进行定点“编辑”，实现对特定DNA或RNA片段的修饰。

基因编辑技术中，以锌指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZFN）和TALEN （transcription activator-like effector nucleases）为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。CRISPR/Cas是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，而且经过不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas9是由一种原始的细菌免疫系统改编而成的，它的作用方式是首先在基因组的一个靶位点上切割双链DNA。

预测的NgAgo结构类由典型的N端、PAZ、MID和PIWI结构域组成，图片来自Nucleic Acids Research, 2021, doi:10.1093/nar/gkab757。

此外，2016年中国河北科技大学韩春雨领衔的研究人员发现来自格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的一种Argonaute蛋白（NgAgo）作为一种核酸内切酶，在向导DNA（guide DNA, gDNA）的引导下，能够在人细胞中进行基因组编辑。但此后国内外多个实验室均表示无法重复韩春雨的NgAgo实验，最终导致这项发表在Nature Biotechnology期刊上的研究惨遭撤回。不过，2021年，美国普渡大学的Kevin V.Solomon团队发现可溶的而不是重新折叠的NgAgo蛋白确实具有切割DNA的核酸内切酶活性。

近年来基因编辑技术迅猛发展，这类技术正引发生物医学研究和治疗变革。它们可用于构建疾病模型，探究不同疾病的致病机理；用于靶向基因治疗；用于小麦、水稻、玉米、大豆、拟南芥、西红柿、烟草、马铃薯等植物和猪、牛、羊等动物的育种；用于微生物改造，为生物燃料、化学品、新材料、医药产品、环境修复微生物等研发提供了新的选择；用于核酸检测，利用CRISPR/Cas12a系统或CRISPR/Cas13a系统检测HPV、寨卡病毒、登革热病毒和SARS-CoV-2等病原体。

在这些应用中，尤其令人关注的是，基因编辑技术有潜力用于治疗一系列疾病，比如唐氏综合征、镰状细胞病、地中海型贫血症、囊性纤维化、脆性X染色体综合征、溶酶体贮积病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、富克斯角膜营养、杜氏肌营养不良和不良强直性肌营养不良I型等遗传性疾病；白血病等血癌以及宫颈癌、三阴性乳腺癌等实体瘤；HIV、曼氏血吸虫和艰难梭菌等病原体感染；帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病；心源性猝死等心血管疾病；糖尿病；急性肾病；肥胖等等。这里，就以唐氏综合征为例，探究一下基因编辑技术在治疗唐氏综合征领域取得的进展。

唐氏综合征（DS），即21-三体综合征，是由染色体异常（比正常人多了一条21号染色体）而导致的疾病。60%患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。唐氏综合征的发病率发生率约为1/800，是人群中发病率较高的一类遗传疾病。唐氏综合征目前并没有特别行之有效的治疗方法，所以还是以预防为主。在以往的医学观点中，通常认为高龄孕妇怀上唐氏患儿的风险较大，但从目前的统计结果来看，唐氏患儿的母亲出现了低龄化的趋势。因此，利用基因编辑技术开发预防和治疗唐氏综合征的方法或许具有极其重要的意义。

1.利用基因编辑治疗唐氏综合征的研究进展

鉴于唐氏综合征的治疗手段严重缺乏，自从基因编辑技术问世而来，科学家们先后采取了多种方法来努力治疗唐氏综合征。这些方法都旨在剔除或沉默额外的21号染色体拷贝。

从DS-ips细胞中靶向移除21号染色体，图片来自Cell Stem Cell, 2012, doi:10.1016/j.stem.2012.08.004。

2012年2月，Li B. Li等人利用AVV载体将含有TKneo基因的DNA盒引入源自唐氏综合征患者的诱导性多能细胞（DS-iPS）的21号染色体的app基因第3外显子靶位点的一个拷贝中。利用新霉素G418对带有该DNA盒的DS-iPS细胞克隆进行阳性筛选，然后利用抗病毒药物更昔洛韦（GCV）进行负性筛选，从而有效产生不含多余21号染色体的ips细胞。

2013年7月，Jun Jiang等人利用基于ZFN的基因组编辑，将XIST基因插入到源自唐氏综合征患者的诱导性多能干细胞（iPS）的一条21号染色体的DYRK1A基因座上。XIST基因会产生一个长链RNA，覆盖住这条21号染色体，从而成功地关闭了整条额外的21号染色体，并使经过基因编辑的ips细胞在功能上恢复正常。这一策略有可能为开发治疗唐氏综合征提供一种新的思路。

通过给21号染色体插入XIST基因成功关闭整条额外的21号染色体，图片来自Nature, 2013, doi:10.1038/nature12394。

2017年3月，Hiroshi Sato等人利用CRISPR/Cas9系统介导的DNA切割后的同源重组，将反向的loxP位点包围的含有GFP（编码绿色荧光蛋白）和HSV-tk基因的DNA盒整合到21三体HeLa细胞的一个21号染色体拷贝中。随后经诱导后表达的Cre重组酶在反向loxP位点标记的染色体上诱导姐妹染色单体重组，产生不稳定的双着丝粒21号染色体和无着丝粒21号染色体。最后，在含有抗病毒药物更昔洛韦（GCV）的培养基中成功筛选出缺乏多余21号染色体的HeLa细胞。

2017年6月，我国科学家将他们设计的敲除21号染色体的CRISPR系统转入唐氏综合征动物模型的细胞中，经过一段时间的培养和筛选后，这些细胞的21号染色体数量逐渐恢复了正常。因此，这套CRISPR染色体敲除系统有潜力可以用于校正已出生的唐氏综合征患儿的21号染色体数量。

2017年11月，我国科学家发现利用CRISPR/Cas9介导的多位点DNA切割特异性清除了源自唐氏综合征患者的ips细胞中的一条21号染色体。这就为利用CRISPR/Cas9介导的目标染色体消除构建动物模型以及治疗非整倍体疾病（比如唐氏综合征）提供了新的策略与方法。

2021年5月，我国科学家发现唐氏综合征患者来源的大脑皮层类器官存在皮层发育缺陷和DSCAM信号通路表达异常，利用使用CRISPR/Cas9基因编辑手段将DSCAM基因敲低可有效挽救唐氏综合征皮层类器官的神经前体细胞增殖能力降低和皮层神经元发生缺陷。

图片来自Journal of Clinical Investigation, 2021, doi:10.1172/JCI135763。

2022年3月，Lei Xu等人利用DS-ips细胞产生GABA能中间神经元和内侧神经节突起（MGE）类器官，发现功能受损的线粒体异常地聚集在GABA中间神经元的核周围区域和源自DS患者的MGE类器官的细胞中，而且DS患者中的线粒体功能受损与DSCAM-PAK1途径相关。利用基因编辑抑制DSCAM-PAK1途径校正了DS患者中的线粒体在细胞核周围区域的异常聚集。

2. 前景展望

尽管科学家们在利用基因编辑技术开发治疗唐氏综合征的方法方面取得一些进展，然而，这些方法中的大多数仍然疗效不高。

众所周知，基因编辑技术存在着一定的脱靶效应，其安全性尚未解决，人们很难预测和评估脱靶效应给DS患者带来的健康风险。此外，目前的大多数针对DS患者的基因编辑研究都是利用细胞实验和动物模型在体外来开展的，尚未开展临床试验，其有效性和安全性仍然是未知的。此外，这些体外研究与DS患者体内的情况相差很大，因此目前将体外对源自DS患者的细胞进行基因编辑的方法直接应用与患者身上并不切实际。尽管2021年8月Julian D. Gillmore等人利用CRISPR/Cas9在6名转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）患者体内进行基因编辑，结果表明这种基因编辑是安全有效的。这一进展虽然令人鼓舞，但是，尚未对这6名患者进行长期随访，而且临床试验规模太小，尚未针对更大规模的人群开展进一步的临床试验。

再者，相比正常人体内仅有两条21号染色体，DS患者体内存在着三条21号染色体。不论采用哪种基因编辑技术，在对DS患者体内的细胞进行基因编辑时，如何确保仅使其中的一条21号染色体失活而不会导致两条甚至三条21号染色体失活也是一个技术难点。此外，如何有效地将用于基因编辑的蛋白或基因递送到DS患者的靶细胞中也是一大挑战。

不过，在未来，随后科学家们从病理学、分子生物学、基因、蛋白和组学等不同角度深入探究ZFN、TALEN和不同类型的CRISPR/Cas系统及其改进版本等基因编辑技术的详细作用机制，有朝一日人们最终能够利用基因编辑技术治疗唐氏综合征。（生物谷 Bioon.com）

参考文献：
1. Feng Gao et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（已被撤回）. Nature Biotechnology, 2016, doi:10.1038/nbt.3547.

2. Kok Zhi Lee et al. NgAgo possesses guided DNA nicking activity. Nucleic Acids Research, 2021, doi:10.1093/nar/gkab757.

3. Li B. Li et al. Trisomy Correction in Down Syndrome Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell, 2012, doi:10.1016/j.stem.2012.08.004.

3. Jun Jiang et al. Translating dosage compensation to trisomy 21. Nature, 2013, doi:10.1038/nature12394.

4. Hiroshi Sato et al. Engineering of Systematic Elimination of a Targeted Chromosome in Human Cells. Biomed Research International, 2017, doi:10.1155/2017/6037159.

5. Erwei Zuo et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Research, 2017, doi:10.1038/cr201781.

6. Erwei Zuo et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted chromosome elimination. Genome Biology, 2017, doi:10.1186/s13059-017-1354-4.

7. Xiao-Yan Tang et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in ipsC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. Journal of Clinical Investigation, 2021, doi:10.1172/JCI135763.

8. Lei Xu et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome ipsC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 2022, doi:10.1016/j.bbadis.2022.166388.

9. Julian D. Gillmore et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2107454.

10. Silvia Natsuko Akutsu et al. applications of Genome Editing Technology in Research on Chromosome Aneuploidy Disorders. Cells, 2020, doi:10.3390/cells9010239.

11. 杨茹清等. 利用基因组编辑技术治疗唐氏综合征探索性研究进展[J]. 浙江医学, 2019, 41(20):2246-2249.