Science：利用CRISPRa和CRISPRi揭示对人类T细胞功能至关重要的基因

2022年2月6日讯/生物谷BIOON/---CRISPR基因组编辑已成为剔除或改变DNA序列并研究其结果的有力工具。如今，在一项新的研究中，来自美国格拉德斯通研究所和加州大学旧金山分校的研究人员利用CRISPR-Cas9系统强行激活而不是编辑人类免疫细胞中的基因。这种称为CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）的方法让他们比以前更彻底、更迅速地发现在免疫细胞生物学中发挥作用的基因。相关研究结果发表在2022年2月4日的Science期刊上，论文标题为“CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells”。

论文通讯作者、格拉德斯通-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所主任Alex Marson博士说，“这是一个令人兴奋的突破，将加速免疫治疗研究。这些CRISPRa实验为了解哪些基因对免疫细胞的每项功能都很重要提供了可靠线索。反过来，这将使我们对如何从遗传上改变免疫细胞有新的认识，以便它们能够成为治疗癌症和自身免疫性疾病的方法。”

这项研究是首次在直接从人身上分离出来的原代人类免疫细胞中大规模地成功使用CRISPRa。这些作者在不同的免疫细胞中激活了基因组中的每个基因，使他们能够平行地测试近2万个基因。这使他们能够迅速了解哪些提供了最有力的杠杆来重编程细胞功能的规则，以便最终可能导致更强大的免疫疗法。

一种新的CRISPR

CRISPR-Cas9基因组编辑系统通常依靠称为“分子剪刀”的Cas9蛋白，在基因组的理想位置切割DNA。

近年来，Marson和他的同事们利用CRISPR的分子剪刀，有选择地去除或者说敲除多种类型的人类免疫细胞的基因，包括调节性T细胞和单核细胞。他们的研究结果已开始阐明免疫细胞如何能够经基因改造后更有效对抗感染、炎症或癌症。不过，他的团队知道，他们仍然遗漏了故事的一部分。

论文共同第一作者、Marson实验室博士后学者Zachary Steinhart博士说，“敲除基因对于了解免疫细胞的基本功能是很好的，但是只进行基因敲除的方法可能会漏掉一些真正关键的基因。”特别是，敲除一个基因并不能告诉你如果你让这个基因更加活跃会发生什么。

全基因组CRISPRa/i筛查发现了原代人类T细胞中刺激反应性细胞因子产生的可调调节因子。图片来自Science, 2022, doi:10.1126/science.abj4008。

因此，这些作者采用了CRISPRa。在CRISPRa中，Cas9蛋白经过基因改造后不再能够切割DNA。相反，科学家们可以在Cas9上附加一种激活剂---一个分子“开关”，这样当它与一个基因结合时，就能激活这个基因。或者，他们可以在Cas9上附加一种抑制剂---一个“关闭”开关，以关闭一个基因，实现类似于典型的基因敲除方法的结果，这种方法称为CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）。

绘制T细胞基因图谱

作为一种免疫细胞，T细胞是人体免疫的关键介质之一；它们不仅针对入侵的病原体，而且还指导其他免疫细胞增加或减少对入侵者或癌细胞的反应。这种信息传递是通过产生称为细胞因子的信号分子来实现的。不同类型的T细胞产生不同的细胞因子组合，而不同的细胞因子或细胞因子组合对免疫反应有不同的影响。

Marson说，控制T细胞产生的细胞因子将为在各种不同的疾病环境中重塑整个免疫反应提供新的机会。但是人们对究竟哪些基因控制哪些细胞因子产生的理解并不全面。

在这项新的研究中，Marson、Steinhart和论文共同第一作者Ralf Schmidt博士及其同事们合作，让CRISPRa和CRISPRi在原代T细胞中高效率地发挥作用---这是以前从未做过的。

Marson说，“这种将CRISPRa或CRISPRi复合物递送到细胞中的效率提高，对于实现全基因组实验和加速发现至关重要。”

这些作者然后使用这些方法激活或抑制了直接从多名健康志愿者身上分离出来的人类T细胞中的近2万个基因。他们筛查了由此产生的细胞，以了解细胞因子产生的变化，并锁定了数百个作为关键细胞因子调节剂起作用的基因，包括一些以前从未在基因敲除筛查中发现的基因。

Schmidt说，“我们的研究证明了这项技术在人类T细胞中的精确性和可扩展性。而且我们很快就了解了你可以开启哪些基因来调控某些细胞因子的水平的规则。”

更好的T细胞疗法

为了治疗某些类型的癌症，临床医生越来越多地使用CAR-T细胞疗法，即从患者体内取出T细胞，在实验室中对其进行基因改造，使其靶向攻击癌细胞，然后将这些经过基因改造的T细胞重新输注到相同患者体内。通过改变T细胞的细胞因子产生来提高T细胞的抗癌能力，可以使CAR-T细胞疗法更加强大。

Marson说，“我们的新数据为我们提供了关于T细胞的极其丰富的指导手册。如今我们有了一种基本的分子语言，我们可以用它对T细胞进行基因改造，使其具有非常精确的特性。”

Marson实验室如今正在研究他们筛选出的一些基因，并努力进一步利用CRISPRa和CRISPRi来发现控制人类免疫细胞中其他关键特征的基因。

Marson说，“与格拉德斯通-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所、创新基因组学研究所和加州大学旧金山分校活体治疗计划合作，我们的团队如今希望利用我们的新指导手册来构建合成基因程序，这些基因程序可以通过CRISPR基因工程设计成下一代细胞免疫疗法来治疗一系列疾病。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Ralf Schmidt et al. CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells. Science, 2022, doi:10.1126/science.abj4008.