**医学期刊NEJM两篇论文揭示阿斯利康新冠疫苗接种后血栓形成的潜在原因

2021年4月10日讯/生物谷BIOON/---用于预防SARS-CoV-2病毒感染的疫苗是对抗2019年冠状病毒（Covid-19）大流行的最重要对策。从2020年12月到2021年3月，欧洲药品管理局在随机、盲法、对照临床试验的基础上批准了4种疫苗，即两种为基于信使RNA（mRNA）的疫苗---BNT162b2（Pfizer–BioNTech）和mRNA-1273（Moderna），它们编码SARS-CoV-2的刺突蛋白抗原，被封装在脂质纳米颗粒中；ChAdOx1 nCov-19（阿斯利康），是一种重组的黑猩猩腺病毒载体，编码SARS-CoV-2的刺突糖蛋白；Ad26. COV2.S（Johnson & Johnson/Janssen），是一种编码SARS-CoV-2刺突糖蛋白的26型重组腺病毒载体。

截至2021年4月7日，欧盟已接种超过8200万剂疫苗；在德国，约有四分之一的疫苗接种者接种了ChAdOx1 nCov-19疫苗。从2021年2月下旬开始，在接种ChAdOx1 nCov-19疫苗后的患者中观察到几例异常血栓事件，并伴有血小板减少。

首发病例（Index Case）

2021年2月中旬（第0天），一位先前健康的49岁医护人员接受了她的第一剂ChAdOx1 nCov-19。在接下来的几天里，她报告说有轻微症状（疲乏、肌痛和头痛）。从第5天开始，她报告有发冷、发烧、恶心和上腹不适；她在第10天被送入当地医院。

表1.首发病例的实验室特征。图片来自NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2104840。

实验室检查结果如表1所示。血小板计数为每立方毫米18000，D-二聚体水平为每升35毫克（参考值，<0.5）。除γ-谷氨酰转移酶和C反应蛋白水平升高外，其他血液检查结果均正常。鼻咽拭子的SARS-CoV-2逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测为阴性。

计算机断层扫描（CT）显示门静脉血栓形成和周围性肺栓塞（peripheral pulmonary emboli）。这名患者接受血小板浓缩液治疗后转入一家三级医院。到达医院后，她有上腹不适和恶心，但其他情况良好（血压，125/88毫米汞柱；心率，65次/分钟；体温，36.5℃）。体格检查时除触诊有中度上腹痛外，无明显异常。她接受静脉注射抗生素、镇痛和皮下注射4000单位剂量的低分子肝素（依诺肝素）。

次日，血小板计数及纤维蛋白原水平仍低，D-二聚体及转氨酶水平升高。腹痛加重，重复CT成像显示门静脉血栓形成进展至包括脾静脉和肠系膜上静脉；此外，肾下主动脉和两侧髂动脉可见小血栓。低剂量静脉注射未分馏肝素（每小时500 IU），但由于突然出现心动过速和担心胃肠道出血，不久后就停止了静脉注射。乳酸水平为3.7mmol/升，患者被转入重症监护室。重复的CT成像显示弥漫性胃肠道出血，因脾静脉血栓形成而导致的肠壁和胰腺灌注减少，并伴有腹水。她接受了红细胞和血小板输注、凝血酶复合物浓缩物和重组因子VIIa，但在第11天死亡。除了诊断的医疗结果外，尸检还发现脑静脉血栓。

表2.对11例患者的临床和实验室资料进行总结。图片来自NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2104840。

系列病例（Case Series）

到2021年3月15日，又有10名可获得临床数据的患者被发现在接种ChAdOx1 nCov-19疫苗5～16天后开始出现一种或多种血栓性并发症。所有11名患者（包括首发病例）的特征见表2。血栓事件包括脑静脉血栓形成（9例）、脾静脉血栓形成（3例）、肺栓塞（3例）和其他类型的血栓（4例）；10例患者中有5例发生了一种以上的血栓事件。在本分析中有1例患者（患者11）出现致命性脑出血。在本报告发表时，脑神经病理分析结果还未出来，脑静脉血栓尚未排除；死后血清可用于检测血小板活化抗体。

在这些患者中，中位年龄为36岁（范围为22～49岁）；11名患者中有9名女性。所有患者均伴有血小板减少症（血小板计数的中位数，约为每立方毫米20000；范围为9000至107000）。其中一名患者已有血管性血友病（von Willebrand disease）、抗心磷脂抗体和第五凝血因子（factor V Leiden）。这些患者在症状发生或诊断为血栓形成之前都没有接受过肝素治疗。鉴于这种疾病与自身免疫性肝素诱导的血小板减少症（一种可由肝素和某些其他阴离子引发的前血栓性血小板减少症，其特点是肝素不依赖血小板活化特性）在临床上的显著相似性，从11名患者中的4名患者获得的血清被转诊用于立即研究针对血小板因子4（PF4）-肝素的血小板活化抗体。在对从患者1至4中获得的血清中的抗体进行表征后，作者随后获得了其余7名患者中5人的血清。此外，这些作者的参考实验室还从被怀疑有与ChAdOx1 nCov-19疫苗接种有关的前血栓性血小板减少症（prothrombotic thrombocytopenia）的患者中收到了进一步的血清样本。（在编写本报告时，尚无这些患者的详细临床资料）。相关研究结果于2021年4月9日在线发表在NEJM期刊上，论文标题为“Thrombotic Thrombocytopenia after ChAdOx1 nCov-19 Vaccination”。

方法

这些作者从全血（从健康志愿者那里获得）中纯化血小板，这些血小板已经用柠檬酸腺苷葡萄糖溶液A进行了抗凝，这些志愿者中没有人服用抗血小板药物或在过去10天内接种过疫苗。这些作者用之前描述的方法制备血小板。在一组实验中，血小板在缓冲液中与ChAdOx1 nCov-19疫苗（1:2000稀释）预孵育并在使用前进行清洗。将清洗后的血小板（75微升）在存在或不存在FcγIIa受体阻断抗体IV.3的情况下，用缓冲液、低分子量肝素（瑞维肝素钠[Abbott]）或PF4（Chromatec）孵育。在一些实验中，加入未分馏的肝素（每毫升100 IU）以抑制PF4依赖性反应，或每孔加入ChAdOx1 nCov-19疫苗（1:50稀释）。在浓度为每毫升10mg的免疫球蛋白(Privigen IVIG[CSL Behring])的存在下，将血清与PF4和血小板一起孵育。在使用初始的四名患者（即患者1至4）的血清建立检测条件后，这些作者研究了另外24例血清样本，这些样本在免疫分析上呈阳性，以便验证他们的发现。他们将这种改良的血小板活化实验称为PF4增强型血小板活化实验。

为了测量直接的抗体结合，这些作者使用了两种免疫测定法：一种是PF4-肝素酶联免疫吸附测定法（ELISA），另一种是PF4 ELISA，通过二级抗人IgG来测量抗体结合。此外，通过固定的PF4-肝素和固定的PF4亲和纯化来自两例血清样本的抗体，并在测定中测试纯化的抗体。

这些根据光密度单位将ELISA中的反应性定义为强（≥2.00）、中等（1.00～1.99）或弱（0.50～0.99）。在PF4增强型血小板活化实验中，反应性根据血小板聚集前所经过的时间进行分级，反应时间越短表明血小板活化越强（强活化，1至5分钟；中度活化，>5至15分钟；弱活化，>15至30分钟）。

结果

初步分析的11名患者均有中度至重度血小板减少和异常血栓形成，尤其是脑静脉血栓形成和脾静脉血栓形成（表2）。这些作者还根据D-二聚体水平大大升高（>10.0mg/升）和国际标准化比值、部分凝血活酶时间或纤维蛋白原水平的一项或多项异常，在5例患者中发现了弥散性血管内凝血的证据。（在6名可获得纤维蛋白原水平的患者中，4人有低纤维蛋白原血症）。

虽然评估不同管理策略的结果不是这项研究的目标，但是这些作者感兴趣地注意到患者2的临床过程，该患者出现肺栓塞和轻度血小板减少症（血小板计数，每立方毫米107000），没有弥散性血管内凝血。该患者接受治疗剂量的低分子量肝素治疗3天，临床好转，血小板计数增加到132000；此时，PF4-肝素ELISA结果为阳性，改用口服阿哌沙班（apixaban），临床和实验室持续恢复。

表2还显示了PF4-肝素ELISA的结果，包括对初始的四名患者（即患者1至4）进行了详细的实验室研究。从这些患者获得的血清在PF4-肝素ELISA测试中显示出强烈的反应性，光密度超过3.00单位（参考值，<0.50）；通过添加肝素（每毫升100IU），所有反应性反应都被抑制到0.50单位以下。图1显示了4名初始患者的血清学特征，这些血清学特征是通过血小板活化实验进行评估的。4例血清样本中的3例在缓冲液对照下表现出弱到中度的反应性，这种反应性可通过低分子量肝素进行抑制。在这三例样本中，PF4（每毫升10微克）极大地增强了反应性；随后，当与其他志愿者的血小板一起重新测试时，患者2的血清在PF4存在的情况下显示出强烈的血小板活化。所有反应均被单克隆抗体IV.3和免疫球蛋白（剂量每毫升10毫克）阻断，这表明血小板活化已通过血小板Fcγ受体发生（图1A）。对照组均未出现血小板活化（数据未显示）。

从富含血小板的血浆中沉淀血小板，随后让沉淀的血小板重新悬浮于清洗缓冲液中，与ChAdOx1 nCov-19疫苗（1:2000）预孵育，离心，重新悬浮于最终的悬浮缓冲液中，或者与ChAdOx1 nCov-19共孵育（1:50），均可增强血小板活化。

图1.患者血清对血小板活化测试和免疫测试中的反应性。图片来自NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2104840。

图1B为24例临床疑似疫苗诱导的免疫性血栓性血小板减少症患者血清样本的血小板活化结果，这些患者在PF4-肝素ELISA筛选中呈阳性。不过大约一半的血清样本（24人中有13人）在缓冲液对照中显示血小板活化，大多数样本（24人中有19人）被低分子量肝素抑制；几乎所有的样本（24人中有22人）在加入PF4后显示血小板活化。除一例血清样本外，其余样本均被高剂量肝素抑制。

图1C显示了从所有28名患者（包括患者1、2、3、4、5、8、9、10和11）中获得的血清样本在PF4-肝素和PF4 ELISA实验中的结果都具有很强的反应性，而且这种反应性可被高剂量肝素抑制。使用固定的PF4或固定的PF4-肝素亲和纯化的抗体显示出与原始血清相同的反应模式，换句话说，它们在每毫升10μg的PF4存在下强烈活化血小板，这种效果被高浓度的肝素完全抑制。

综上所述，在这项研究中，接种ChAdOx1 nCov-19疫苗可导致针对PF4的血小板活化抗体介导的罕见免疫性血栓性血小板减少症，这种免疫性血栓性血小板减少症在临床上类似于自身免疫性肝素诱导的血小板减少症。

与此同时，在欧洲的另一个国家：挪威，生活在公共机构中的老年人和与Covid-19患者有密切接触的医疗专业人员已被优先接种BNT162b2 mRNA Covid-19疫苗（Pfizer–BioNTech）。此外，ChAdOx1 nCoV-19疫苗已被接种给65岁以下、与Covid-19患者无密切接触的医护人员。截至2021年3月20日疫苗暂停接种时，挪威共有132686人接种了第一剂ChAdOx1 nCoV-19疫苗，没有人接种第二剂疫苗。

在接种第一剂ChAdOx1 nCoV-19疫苗后10天内，5名患者医护人员出现严重血小板减少，而且在异常部位有血栓形成。其中的4名患者出现了严重的脑出血。这5名患者在奥斯陆大学医院接受治疗。

基于此，挪威研究人员在另一项研究中报告了这5名患者在接种第一剂ChAdOx1 nCov-19疫苗7至10天后出现静脉血栓和血小板减少。这5名患者为32～54岁的医护人员，都有高水平的PF4-聚阴离子复合物抗体；但是，他们以前没有接触过肝素。鉴于这5例患者发生在挪威13万多名接种疫苗者中，这些研究人员指出这些患者代表了一种罕见的疫苗相关的自发性肝素诱导的血小板减少症的变体，他们称之为疫苗诱导的免疫性血小板减少症。相关研究结果于2021年4月9日在线发表在NEJM期刊上，论文标题为“Thrombosis and Thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 Vaccination”。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Andreas Greinacher et al. Thrombotic Thrombocytopenia after ChAdOx1 nCov-19 Vaccination. NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2104840.

Nina H. Schultz et al. Thrombosis and Thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 Vaccination. NEJM, 2021, doi:10.1056/NEJMoa2104882.