微生物学报Acta Microbiologica Sinica 48(7)：863~868;4 July 2008 王琰，魏金花，沈立新，段康民*（西北大学生命科学学院，西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，西安710069） 摘要：【目的】针对铁这种几乎所有微生物都必需的，对病原菌尤为重要的营养元素，在全基因组水平上检测铜绿假单胞菌的铁感应基因。

生物工程学报 Chin J Biotech 2008, March 25; 24(3): 368-375 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn . 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserv

2　讨论 　　以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子克隆方法，它们分别具有不同的特点和适用范围。 　　利用启动子探针载体筛选启动子时，不需要知道具体的基因序列，避免了引物设计，并能获得大量的启动子片段；其缺点是需要构建1个穿梭质粒，建库、转化、筛选，工作量大，费时费力，而且克隆、亚克隆的过程繁琐。因此在基因的遗传背景不是很清楚时，往往通过探针载体随机筛选启动子。

1.6　TAlL-PCR 　　很早就有用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列...

1.4　利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子 　　 这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。

　1.3　环状 PCR 　　环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 　　1.3.1　I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。

随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 　　迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。

LICR ( Ludwig Institute for Cancer Research) 以及UCSD (University of California, San Diego) 的研究人员找到一个方法，可以鉴定基因组中能调控基因表现的functional elements。