单细胞mRNA测序 - 陈巍学基因（11）
单细胞mRNA测序是很有用的科研方法。
本课程介绍其中2种：Clontech公司的SMART-seq方法，和EpiCentre公司的TargetAmp方法。2种方法各有巧妙，即大量扩增了核酸，又尽可能减少核酸扩增过程中的偏差、失真。
免疫细胞治疗技术
免疫细胞治疗技术（CIK）细胞制品制备的质量控制，
一、学科基本情况-基础科研平台：
拥有两个细胞培养室，其中一个用于第三类医疗技术相关细胞 制品临床前的中试试验；
二、GMP洁净室情况-硬件设施；
三、研发技术团队；
四、细胞制品质量控制；
五、细胞制品质量标准；
六、细胞制品放行条件
七、制备记录及原始数据管理
八、现有数据资料初步总结
体细胞免疫治疗及联合肿瘤常规治疗的基本原则
体细胞免疫治疗指向肿瘤患者输入具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗肿瘤的目的。常用的体细胞免疫治疗方法包括：树突状细胞疫苗（DC ）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、DC刺激的CIK细胞（DC-CIK）、半合子DC刺激的CIK细胞（半合子DC-CIK）及自然杀伤细胞（NK）等。DC是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，通过对肿瘤抗原的摄取及抗原提呈，可有效地诱导及活化免疫效应细胞，从而介导强大的特异性肿瘤免疫。
CIK细胞是将人的外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。DC-CIK指通过体外诱导有功能的自体DC细胞，将这种有功能的自体DC细胞激活自体CIK< /SPAN>细胞，产生一种更强的抗肿瘤的效应细胞，从而发挥其抗肿瘤作用。NK细胞来源于造血细胞，它们不依赖抗原刺激作用，就可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，因此，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。
半合子DC-CIK 指从患者体内分离培养CIK细胞，再从患者子女体内分离培养DC，两者混合后回输给患者。体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本原则是根据不同肿瘤的生物学特性、患者的遗传背景、目前的病情状况、前期治疗方法、年龄等，在传统肿瘤治疗模式的基础上，制定出适合病人的个体化体细胞免疫治疗方案。体细胞免疫治疗可以作为综合治疗的一部分, 在肿瘤负荷降低后接受治疗；还可联合细胞因子、抗肿瘤抗体、生物靶向药物以取得更好的疗效。
围产期间充质干细胞: 从基础到临床
围产期间充质干细胞（Perinatal mesenchymal stem cells, P-MSC）又称出生相关组织源间充质干细胞，指的是胎盘、脐带、脐带血等围产期组织来源的间充质干细胞，具有广阔的应用前景。我们对人P-MSC的鉴别、分离、培养、产品制备与保存及应用进行了系统研究。
首先建立了从人胎盘、脐带和脐血等组织中鉴别、分离、规模制备出高纯度P-MSC的技术体系，建立了低血清培养技术，冷冻保存技术、发明并构建了P-MSC种子库、产品库、生物学功能综合分析的技术平台。制备的P-MSC具有产量高、纯度高、培养时间短、细胞活力强、安全性好等优点。在此基础上，我们建立《注射用间充质干细胞制造和检定规程》以及多种相关技术标准，获产品执行标准证书。这些标准为国家行业标准的制定提供了依据，为干细胞新药研发奠定基础。
其次，我们系统地研究了P-MSC与骨髓MSC生物学特性和功能的异同，发现P-MSC与骨髓MSC有类似特性，但增殖分化能力更强，免疫原性更低，具有很好的造血支持、免疫调节以及组织修复与再生功能，其机制与P-MSC分泌众多因子和PGE2等有关。P-MSC不具致瘤性, 也无明显促瘤性, 对白血病生长有抑制作用。由于胎盘脐带取材方便，P-MSC的提取和应用系变废为宝且不存在伦理问题，特别易于产业化操作。
随后，我们对P-MSC的治疗潜能进行了探索性研究，发现P-MSC对血液病，自身免疫性疾病、糖尿病、心脏病等疾病有治疗潜能，其机制与MSC免疫调控，支持造血，促进血管新生和组织修复有关。对一些重症患者开展了实验性治疗研究, 已经取得的资料表明P-MSC安全性和疗效良好，为进一步的大样本随机对照临床研究的开展奠定了基础。
成体干细胞基因修饰策略及应用基础研究
成体干细胞包括造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞等多种类型，在多种疾病的治疗的治疗中具有广阔的应用前景。但是，成体干细胞临床应用依然存在植入效率低、功能不显著等问题。干细胞治疗通过组织重建以及分泌生长因子等综合机制发挥治疗作用。利用特定功能的基因修饰有望提高成体干细胞的治疗效果。
重组腺病毒是应用最广泛的基因转移载体，但部分干细胞缺乏其受体CAR，因而其感染效率很低。另外， 腺病毒载体携带外源基因的容量有限。为提高重组腺病毒载体修饰成体干细胞的效率及治疗效果，我们进行了一下工作：
（1）重组腺病毒载体的改构： 对5型腺病毒载体的纤维顶球进行了改造，将其替换为B组11p型腺病毒（Ad11p）的纤维顶球，从而改变了它的靶向性，增强了对造血细胞的感染效率；改构腺病毒通过CD46介导而实现对血液细胞的感染；通过和甲病毒的融合，提高重组腺病毒携带外源基因的容量及表达效率；构建了外源基因非整合于基因组的重组腺病毒载体。
（2）成体干细胞基因修饰提高存活及植入效率。鞘氨醇激酶（SPK）是一种具有抑制细胞凋亡作用的信号分子,其产物S1P对干细胞具有广泛的调控作用。SPK基因修饰可以明显提高骨髓MSC胞内SPK酶活性并促进细胞的存活和归巢，表明SPK基因修饰是提高MSC应用效率的有效策略。
（3）肝细胞生长因子（HGF）基因修饰干细胞特性及应用。生长因子的基因修饰也是增强干细胞治疗效果的重要措施。肝细胞生长因子（HGF）是一种具有促进肝再生、血管生成和抑制纤维化等多种功能的生长因子。在实验动物模型中，HGF基因修饰的骨髓MSC对心肌缺血、放射性肺损伤、肝脏损伤、股骨头坏死等损伤性疾病具有较好的治疗效果。成体干细胞基因修饰能够提高干细胞对疾病的治疗效果，并在多种疾病的治疗中具有广阔的应用前景。
间充质干细胞的免疫调解机制及临床应用
间充质干细胞（MSC）具有低免疫原性及向缺血或损伤组织归巢的特征,输入宿主体内后,可归巢于特定部位,在微环境影响下定向分化为内胚层、中胚层以及外胚层3个胚层来源组织的细胞,如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等10余种成熟细胞.因而成为再生医学中器官修复的理想种子细胞。近年来研究发现除多向分化潜能外，MSC还具有较好的免疫调控作用，主要免疫调控机制为1）抑制T细胞增殖,诱导T淋巴细胞亚群由Th1、Tc1向Th2、Tc2极化；2）抑制DC细胞成熟与分化,减少DC细胞IL-12及TNF-α的分泌；3）上调CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞,诱导免疫耐受；4）抑制细胞毒T细胞,避免或逃逸被细胞毒T细胞和NK细胞攻击。基于对其作用机制的明确及体外细胞水平和动物模型水平的研究基础，目前已有较多应用MSC于异基因造血干细胞移植后的移植物抗宿主病（GVHD）的防治；再生障碍性贫血(AA)、系统性红斑狼疮及多发性硬化等自身免疫性疾病的治疗的临床研究。
在GVHD防治方面，迄今为止在Clinical. trial 登记的临床研究有近20项；初步的结果显示了较好的安全性和有效性，可显著降低GVHD发生率，减少移植相关死亡率（TRM）,但Katarina Le Blanc于2008年发表在Lancet上的一项多中心研究提示早期预防性输注MSC也可增加白血病复发风险，目前多数研究者倾向于将MSC用于激素耐药或难治性GVHD的治疗，我们采用供者或第三方来源的的骨髓MSC每周一次静脉输注治疗了20例移植后GVHD患者[平均输注量:0.8 (0.23~2.1)×106/kg;平均输注次数3(1-5)次],结果治疗组总体有效率(CR+PR)达70%;且发现MSC对移植后肝脏GVHD及皮肤GVHD疗效更为显著，而并不增加疾病复发风险;另外第三方供者的MSC联合脐血干细胞输注对移植后造血恢复不良也有较大改善。
再生障碍性贫血（AA）是一类T细胞介导的骨髓造血衰竭性疾病，目前临床除部分患者采用骨髓移植或强化免疫抑制治疗外并无更好的方法，我们的研究发现AA患者血浆及外周血CD3+,CD8+细胞内IFN-γ,TNF-α高表达；骨髓液及血清中游离TNFR1、TNFR2等负调控因子水平也较高；AA患者T细胞亚群的异常除CD4+T/CD8+T细胞；Th1/Th2细胞失衡外，还存在CD4+CD25+FoxP3+Treg表达减低；另外也发现DC1与成熟DC1的失衡可能在AA发病环节中具有重要作用。早期的动物模型研究证实了免疫细胞治疗可促进经放射造模的骨髓衰竭小鼠造血恢复,并证实其机制为抑制DC细胞成熟与分化,减少DC细胞IL-12及TNF-α的分泌，体外细胞实验则证实MSC可抑制AA患者外周血T细胞增值；下调AA患者GATA-2、PPARγ表达及BMNC凋亡率；上调AA患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的表达；经总结我们在Clinical trial 登记的关于MSC治疗AA的前瞻性多中心的临床研究，25例的初步结果显示：BMSC输注射治疗AA可上调其Treg水平，与传统IST相比，总有效率更高，安全性好，长期疗效及不同类型AA的疗效差异有待扩大病例数进一步研究。
MSC对其它自身免疫性疾病如多发性硬化也有较好的疗效，小样本的临床研究与传统激素治疗相比，MSC治疗可减少疾病复发，无明显毒副作用。
总之，由于MSC与T、B淋巴细胞、NK细胞、DC细存在交互作用的免疫调控作用，其在白血病移植后GVHD、AA、多发性硬化等自身免疫性疾病方面有较大应用前景，值得进一步深入研究。
骨髓间充质干细胞治疗矽肺的基础与临床研究
较石英尘和博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型，我们发现，1.共同点：两种模型的肺泡炎和肺纤维化程度均随时间逐渐变的更严重，最终结局均为肺组织纤维化。2.不同点：BLM组14d时肺纤维化最严重，而SiO2组7d时纤维化与对照组同期相比无统计学意义。 免疫组化显示TNF-α表达量在BLM组7d时最高，在14d时SiO2组高于BLM组；CD68表达量在SiO2组14d时最高，在BLM组7d时低于本组14d时，低于SiO2组同期。TNF-α和CD68表达量在SiO2、BLM两组各时段均较对照组高。
在动物研究基础上，我们做了初步临床研究。2008年10月至2010年5月对10例矽肺患者采用自体BMSCs移植治疗，其中7例患者采用单独自体BMSC移植治疗，3例患者（Ⅱ期1例，I期2例）采用肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）基因修饰的自体BMSCs治疗。结果：
1.临床症状改善情况：治疗后观察患者6～9个月，所有患者咳嗽、咳痰、胸闷、气紧等呼吸系统症状基本消失。
2．血清CP和IgG水平的变化：治疗后血清CP和IgG水平下降明显，与治疗前比较差异有显著性意义。
3．T细胞亚群变化：治疗后T细胞亚群变化与治疗前比较差异无显著性。
4．肺通气功能变化：治疗后FVC、FEVl.0有明显增加，与治疗前相比差异有显著性。
思考与展望：
1. 通过内源的、外源的甚至经过基因修饰的干细胞使组织再生，是一个很有前途的新的治疗方法；
2. 矽肺的发病机制非常复杂，故其治疗的难度很大。建议开展多环节的防治合作。
干细胞研究所承诺的未来
该项研究是通过人体干细胞进行研究，而不是通过动物干细胞，可以在培养皿里面，一再重复疾病各种疾病的进程，观察到细胞层次的转换发生了什么问题、可以早到病人还没有出现疾病症状之前，这样的研究开启了一种可能性，在不久的将来，以人体细胞来进行药物测试，可以成为标准的研究流程。在目前，进行药物测试的方法有相当多的问题，要把一种新药导入到市场，平均要花13年的时间，并且花费40亿美元的成本，才能完成，而且在新药研发的统计上，只有百分之一的比例能成功进行到市场导入的阶段，你无法想象在其他的行业中在发发展并成功推出一项新产品时，会有这么高的成本和时间，这样的模式在商业上非常糟糕，从社会的角度来看更糟糕。
从目前开发新药的方式，是将一些可能具有效果的化合物，在还没有人体细胞的疾病模式的方式之前，只能利用老鼠或是其他动物的细胞来进行药物试验，但是这些被拿来做试验的动物细胞，并不具备我们想治疗的疾病的特性，毕竟人不是老鼠，你也不可能直接找一个病人，直接取出他的脑细胞或是心血管细胞，拿到实验室里来测试可能具有疗效的新药，而我们发展出这种人体干细胞的研究方式之后，就可以制造出疾病患者的各种细胞分身，例如运动神经元细胞，心血管细胞，肝脏细胞，来进行药物测试，可能有效的化合物，用在实际的细胞上，来验证想要发生的效果，现在有办法做到了，这绝对是空前的突破，你将可以从一开始的时候，从药物分析开发与测试的最早阶段，而不是等了13年的时间，直到药物导入市场的阶段，才发现没有疗效，甚至更糟的，是会伤害到人体的，更进一步来说，只从一小群人的细胞来做这样的实验是不够的，如果我们退一步来看，必须从更广泛的角度来思考，一种疾病对不同人的影响很可能不一样。两个相同疾病的病人，进行相同的治疗，也可能因为两个人的基因组成不同，而产生不同的治疗结果，有可能同样的药物对其中一人游神奇的疗效，对另一个人却完全没有效果。
干细胞改善股骨头坏死缺血状态的研究
输注改善股骨头坏死缺血状态的机理和疗效。方法（1）动物实验：2004年1月～2004年6月采用液氮冷冻股骨头缺血性坏死模型建立方法，双后肢股骨头均制作缺血模型，右侧为移植组，左侧为对照组。抽取骨髓，将所获单个核细胞经右股动脉注入；同法将生理盐水注入左侧股动脉内。（2）临床研究：2004年7月～2011年6月265例成人缺血性股骨头坏死（ANFH）患者接受自体BMSC和PBSC治疗，按国际分期标准（ARCO）分期，设自身前后对照方法进行疗效观察。
BMSC组107例和PBSC组158例在DSA下行超选择性股骨头供血动脉干细胞输注，第3、6、12、24个月进行髋关节Harris评分做疗效评价，6个月复查股骨头供血动脉造影观察血管新生情况。每间隔6个月复查影象学变化。结果（1）动物实验结果：①20只兔均进入结果分析。②DSA动脉造影结果：移植后4周移植组兔右后肢股骨头区供血动脉较对照组股动脉明显增多。③病理结果：移植后12周右侧股骨头软骨、板层骨及骨小梁明显修复，左侧股骨头坏死无改善。（2）临床研究结果：①265例患者随访6～64个月（平均38.2个月），髋关节疼痛缓解226例（85.1%），关节功能改善164例（62.0%），196例（73.9%）行走间距延长。②影像学检查：干细胞治疗后6个月58例患者行股骨头供血动脉造影检查，显示供血动脉较移植前明显增多、增粗，血流速度增快； 12～24个月121例患者XP、CT、CRI检查结果示股骨头缺血坏死病变无进展或改善。③BMSC组和PBSC组疗效对照结果无显著差异，但PBSC组患者依从性好于BMSC组。结论 干细胞改善ANFH缺血状态经过三个阶段：第一阶段是治疗后1～21天为细胞因子分泌期，可使髋关节疼痛得到暂时缓解；第二阶段是治疗后3～6个月为血管新生期，在缺血的股骨头区形成新生血管网络，使临床症状得到持续改善。第三阶段是治疗后12～24个月为骨新生期，股骨头发生组织学变化，使病情进一步好转或痊愈，配对t检验干细胞移植术后与术前Harris评分总分对照，髋关节功能改善有极显著意义（p﹤0.01）。
本项研究结果表明干细胞治疗ANFH的适应症为国际分期Ⅰ～Ⅲ期初患者，如股骨头明显塌陷、变形效果不佳，应考虑外科手术治疗。影响干细胞移植疗效的主要因素有（1）干细胞的数量和质量；（2）干细胞移植的时间和路径；（3）患者自身影响干细胞存活和分化的因素（目前尚未明确）。尚有一些问题需要解决，如干细胞治疗的最佳时机、干细胞在缺血组织内的旁分泌作用和增殖分化潜能、新生血管再狭窄预防等，均有待进一步研究。经动脉干细胞输注治疗ANFH方法简便，安全有效，对缺血病变的股骨头无再次损伤, 患者依从性好，在治疗中未发生不良反应，为缺血性股骨头坏死患者提供了一种新方法。