冷冻电镜技术研究成果新进展！

本文中，小编整理了近期科学家们在冷冻电镜研究领域取得的新进展，分享给大家！

图片来源：cs.wikipedia.org

【1】Cell Discov：揭示人源DNA复制起始复合物ORC的冷冻电镜结构

doi：10.1038/s41421-020-00232-3

2020年11月24日，北京大学生命科学学院高宁研究组在Cell Discovery杂志发表题为“Structural insight into the assembly and conformational activation of human origin recognition complex”的研究论文，报道了人源DNA复制起始复合物ORC组装过程中两个关键复合物ORC2-5和ORC1-5的冷冻电镜结构，从结构上部分阐释了人源复制起点识别复合物ORC的分步组装和逐步激活的分子机制。

真核生物DNA复制包含有一个复杂的复制起始调控机制，以保证在一个细胞周期内基因组仅复制一次。复制起始的第一步是由ORC（由ORC1-6六个亚基组成）识别并标记DNA复制起始位点，然后招募复制解旋酶，组装成复制体。ORC的功能紊乱与一些人类疾病直接相关，ORC亚基的突变与罕见遗传发育疾病MGS（Meier-Gorlin syndrome）直接相关。MGS患者在胚胎期生长迟缓并伴随多种发育畸形，出生后发育也严重受阻并导致身材矮小、小耳症和膝盖骨缺失等症状。此外，一些致病性DNA病毒（如人类疱疹病毒）需要劫持人源DNA复制系统进行病毒基因组的复制，它们通过招募ORC到病毒DNA复制起点实现这一过程。

【2】Science：冷冻电镜揭示转录背后的故事

doi：10.1126/science.abd1673

在转录阶段，RNA需要在正确的位置终止，究竟是谁在负责这一过程？五十年前，科学家们推测到一个可能的模型：一种六聚体环状的RecA家族RNA转位酶ρ（Rho），能够先与RNA结合，参与ATP驱动的RNA聚合酶向RNA的转位，当RNA聚合酶停止时，ρ便帮助特定的RNA片段从DNA上离开。这也是教科书里面给我们的解释。但是，一些研究者意识到这种说法证据不足，转录终止机制依然不明。

近日，由柏林自由大学的Markus C. Wahl团队和俄亥俄州立大学的Irina Artsimovitch团队共同在Science杂志上发表题为Steps toward translocation-independent RNA polymerase inactivation by terminator ATPase ρ的研究论文。在这篇研究论文中，作者采用冷冻电镜（cyroEM）单颗粒分析技术解析了ATP酶ρ在发挥作用过程中所形成的转录复合体的结构，捕获了大肠杆菌DNA上RNA聚合酶转位的图像，揭示了ρ终止基因表达的真正过程，再次加深了我们对转录过程的精确认识。因为ρ能够在几分钟甚至几秒钟的时间内使复合物解体，所以这个复合体非常难以获得。研究人员非常巧妙地使用冷冻电镜，在复合物解体之前，捕获了在大肠杆菌中的DNA模板上运行的RNA聚合酶的图像。结果表明在ρ介导的延伸复合体（elongation complex，EC）解体的途径中，RNA聚合酶（RNAP）、转录因子NusA和NusG发挥了关键作用。

【3】Nature子刊：解析朊病毒蛋白淀粉样纤维冷冻电镜结构

doi：10.1038/s41594-020-0441-5

2020年6月8日Nature Structural & Molecular Biology以长文（Article）形式在线发表了武汉大学团队和中国科学院上海有机所交叉中心团队的最新研究成果。研究人员首次在原子水平上解析了全长朊病毒蛋白纤维的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了细胞型朊蛋白向病理型朊病毒蛋白结构转变的分子机制，为发展新的基于朊病毒蛋白纤维结构的prion疾病治疗药物奠定了基础。

传染性海绵状脑病（TSE）或prion疾病是一类致死的神经退行性疾病，由朊病毒蛋白（PrP）在体内发生错误折叠而引起，影响包括人在内的多种哺乳动物。朊病毒蛋白由宿主基因PRNP编码，正确折叠的蛋白质不仅没有致病性和感染性，还具有重要的生理功能；其错误折叠后则会转变为具有感染性的朊病毒(prions)，能够使许多哺乳动物患病，给人类健康带来了重大威胁。

【4】Cell Res：人源七聚体Pannexin 1通道的冷冻电镜结构研究取得进展

3月12日，Cell Research 期刊在线发表了题为《人源七聚体Pannexin 1通道的冷冻电镜结构》的研究论文。该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室竺淑佳研究组与复旦大学生物医学研究院王磊课题组和中科院上海药物研究所余学奎课题组联合完成。

细胞之间的交流是细胞发育及细胞稳态维持的基础。Pannexin蛋白通道家族是一类大孔径通道，在细胞与细胞之间的交流过程中起着至关重要的作用。其中，Pannexin 1是研究最为广泛的一种亚型。它广泛参与三磷酸腺苷（ATP）及离子的通透，与多种生理功能和病理机制密切相关。前期，复旦大学王磊课题组在四个独立家系中发现由Pannexin1基因突变引起的孟德尔显性遗传病，这些突变体通过影响蛋白糖基化和加速 ATP 释放最终导致卵子死亡（Sang et al.， Sci Transl Med. 2019）。在此研究中，竺淑佳研究组通过爪蟾卵母细胞的电生理实验，证实这些突变体可以激活Pannexin 1通道的活性。但因缺乏Pannexin通道蛋白的高分辨率三维结构，限制了这些突变体分子机制的解析及靶向药物的设计。

【5】Nat Commun：解析人类疱疹病毒6B型近原子分辨率冷冻电镜结构

doi：10.1038/s41467-019-13064-x

近日，中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心、生命科学学院教授毕国强课题组、美国加州大学洛杉矶分校教授周正洪课题组与华东师范大学研究员梅晔合作，利用高分辨冷冻电镜单颗粒分析技术首次解析了人类疱疹病毒6B型的近原子分辨率结构。相关研究成果以Atomic structure of the human herpesvirus 6B capsid and capsid-associated tegument complexes 为题，于11月25日在线发表在Nature Communications杂志上。

人类疱疹病毒6型（HHV-6）属于疱疹病毒家族β疱疹病毒亚家族，根据其表面抗原不同，又被分为HHV-6A和HHV-6B两类密切相关的病毒类型。很多幼儿都会被HHV-6病毒感染，并可能产生发烧、腹泻、红疹等临床症状；HHV-6病毒能够在人体中终身潜伏，并在免疫力低下的人群中引发严重疾病，它在脑组织中的二次爆发将导致患者认知紊乱、残废或者死亡；研究显示，HHV-6病毒甚至还与阿兹海默症和癫痫有关。HHV-6病毒的感染造成了广泛的危害，但目前尚没有其病毒高分辨结构，以及基于结构的药物或者疫苗抗病毒方案。由于与宿主细胞高度黏合，HHV-6B很难实现体外增殖培养，这成为其原子分辨率结构解析的一大难题。

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【6】Nat Commun：中国科学家拓展冷冻电镜解析生物大分子结构的分辨极限

冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术已经成为结构生物学众多结构解析方法中异军突起的一支，在膜蛋白的结构解析中更是发挥着与日俱增的作用。目前的冷冻电镜单颗粒技术已经能较容易地将分子量大于300千道尔顿且生化性质稳定的蛋白质解析至近原子分辨率（约3 埃水平）。但由于小分子量蛋白质（一般为小于200千道尔顿）颗粒在冷冻样品中衬度不足等原因，小分子量蛋白质的高分辨解析工作对目前的技术手段而言仍然是很大的挑战。

在国家重点研发计划“蛋白质机器与生命过程调控”重点专项的支持下，清华大学王宏伟教授团队研发利用球差校正器-电压相位板联用冷冻电镜成像系统，大幅度地提升了蛋白质颗粒在照片中的衬度，同时又保存了足够多的高分辨率结构信息用于后期三维重构。在此基础上，利用自主研制的单层大单晶石墨烯载网来冷冻蛋白质样品，使得吸附在亲水化石墨烯表面的蛋白分子免于气液界面造成的分子结构变化，保存了更完整的结构信息。结合两种技术的优势，分别得到了分子量大小为52千道尔顿的链霉亲和素蛋白，以及在结合与未结合小分子生物素两种状态的近原子分辨率结构，创造了利用单颗粒技术解析近原子分辨率蛋白结构的分子量最小值新纪录，拓展了该技术的应用极限。

【7】Nat Methods：科学家提出一种新型的冷冻电镜三维重构算法

doi：10.1038/s41592-018-0223-8

近期，清华大学生命科学学院李雪明研究组等机构的科学家们在Nature Methods杂志上发表了“A particle-filter framework for robust cryoEM 3D reconstruction”的研究论文。该工作通过将电子工程应用中的粒子滤波算法引入到冷冻电镜三维重构中，大幅提高了对系统参数的搜索能力和对系统误差的容忍度；通过进一步融合高性能计算的方法，最终实现了对生物大分子结构高效高精度的三维重构。同期开发的THUNDER冷冻电镜三维重构软件系统集成了这些新算法和新特性，为未来冷冻电镜海量图像数据的实时分析，以及大规模的自动化应用提供了一个可靠的算法和软件基础；同时，也为解析接近原子分辨率的生物结构提供了一套鲁棒、快速的解决方案，显着降低了对用户经验的要求，益于冷冻电镜技术的广泛普及，助力在原子尺度上对生命活动进行观察。

蛋白质是生命体的最主要组成元素，作为一种生物大分子机器，蛋白质功能的实现高度依赖于其复杂的三维原子结构。了解蛋白质的结构及其与功能的关系对探索生命的基本原理，理解疾病的分子机制以及药物的研发具有重要的意义。冷冻电子显微镜，简称冷冻电镜，使用电子束作为光源，是一种能在原子分辨率水平上观察并测定蛋白质分子结构的有力工具。伴随着最近几年的技术突破，冷冻电镜三维重构技术成为测定蛋白质及其复合物结构的关键技术。冷冻电镜三维重构的基本方法是，首先利用冷冻电镜对冷冻于液氮温度的生物大分子颗粒进行成像，以获得数万到数百万张生物大分子照片，然后通过一定的算法来整合这些图像，计算出生物大分子的三维结构。这其中三维重构算法是核心内容，用于测定出每一张照片的诸多参数，例如空间取向，然后才能将二维的照片整合重构出三维的结构。因为照片的数量巨大，且图像信号极其微弱，如何精确计算测定每张照片的参数，以达到超过0.4甚至0.2纳米的分辨率，一直以来都是冷冻电镜技术研究的重点和难点。

【8】Nature & Science：冷冻电镜技术揭示Hedgehog信号复合体的结构

doi：10.1126/science.aas8843   doi：10.1038/s41586-018-0308-7

Hedgehog信号通路对于胚胎细胞的发育具有重要的作用，该信号的缺失会导致先天性缺陷的发生。然而，对于多数癌症。例如基底细胞癌、脑癌、乳腺癌以及前列腺癌来说，该信号的强度却失去了控制。

冷冻电镜技术的发展帮助我们揭示了Hedgehog信号的分子机制。通过对蛋白结构的进一步认知，能够帮助我们开发靶向该信号的药物分子。在最近发表在《Science》杂志上的一篇研究中，来自西南医学中心以及洛克菲勒大学的研究者们解析出了原子水平的蛋白结构。研究结果显示，两个PTCH-1分子能够同时结合一个Hedgehog（HH）分子，但结合位点处于不同的部位。这一结合方式对于该信号的传递是十分必要的。

冷冻电镜的好处在于能够将样品温度降至足够低，从而不会有冰晶的产生。这一技术对于观察分子结构具有很大的帮助。在上个月发表在《Nature》杂志上的文章中，作者等人利用冷冻电镜技术解析了PTCH1与HH一对一的结合结构。生化检测结果表明这种结合方式并不能充分地释放其活性。

【9】Nature：科学家如何利用冷冻电镜技术阐明主要药物靶点之间的相互作用？

doi：10.1038/s41586-018-0215-y

近日，一项刊登在国际杂志Nature上的研究报告中，来自美国国家癌症研究所的科学家们通过研究首次对人体大型细胞通信网络的两大关键组分之间的相互作用进行了直观性地研究，该研究有望帮助研究人员开发出治疗偏头痛和癌症等一系列疾病的副作用较小的高效疗法。

文章中，研究人员利用了一种新型的原子分辨率成像技术揭示了，名为视紫红质的G蛋白偶联受体（GPCR）能绑定到抑制性的G蛋白上，从而就为研究人员提供了一种蓝图，来设计高精准性的选择性药物。研究者H. Eric Xu博士说道，阐明这种复合物的结构有望开启分析GPCR故事缺失的一章，从而就能揭示这两种分子是如何以一种精细化地方式相互作用的。生物学中的一切都是基于分子间的相互作用，因此关于两种分子的结构如何发挥作用，我们知道的越多，我们就越能掌握更多信息去改善并且开发副作用较小的药物。如今研究人员的发现也基于使用了一种名为冷冻电镜（cryo-EM）的革命性技术，该技术能帮助科学家们更加清晰地观察他们难以想象的分子。Sriram Subramaniam博士说道，利用冷冻电镜技术获得重要药物靶点的结构信息，比如多种状态下的GPCRs，这就说明如今研究人员可以利用这些方法用来发现新药物了。

【10】Cell：人源Dicer与Dicer-pre-miRNA复合体的冷冻电镜结构

doi：10.1016/j.cell.2018.03.080

4月26日，清华大学生命学院等机构的研究人员在Cell期刊发表了题为“Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate”的研究论文，首次报道了人源核酸内切酶Dicer蛋白的全长高分辨率结构，同时还报道了人源核酸内切酶Dicer蛋白结合一种小RNA前体pre-let-7底物的两种不同结构状态。RNA干扰（RNAi， RNA interference）是敲低一个基因表达的最为常用的一种手段。内源性引起RNA干扰的小RNA主要是微小RNA （miRNA）。 到目前为止，人体内已经发现多达1800种微小RNA，越来越多的文献报道认为很多肿瘤的发生发展、转移等行为与微小RNA的异常表达密切相关。

人体内绝大部分微小RNA成熟形成都离不开一种核酸内切酶，我们称之为Dicer的蛋白。有趣的是人体内只有一个拷贝的核酸内切酶Dicer基因，表达唯一的一种人源核酸内切酶Dicer蛋白，然而却负责人体内绝大部分微小RNA的形成。因此，核酸内切酶Dicer蛋白在人体细胞中的重要性不言而喻。核酸内切酶Dicer蛋白是一种只切割双链RNA底物的内切酶，分子量大小约为220 kDa，有多个结构域组成。其中有的结构域负责结合RNA底物，有些结构域负责切割RNA底物，还有些结构域就像一把尺子，精确测量出RNA需要被切割的位置。人源核酸内切酶Dicer蛋白能够识别细胞内众多不同的微小RNA前体底物，然后加工生成具有共同特征的长度约为22碱基和3＇末端有两个游离碱基的成熟小RNA。（生物谷Bioon.com）

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