Nature：放疗“双刃剑”新发现——警惕！它可能在助推远处转移

临床迷雾——放疗后，转移灶怎么反而长大了？

研究人员首先关注了一项针对晚期实体瘤患者的多位点立体定向放疗（SBRT）临床试验（Clinical Trials.gov ID: NCT02608385）。他们对11名患者的22份肿瘤活检样本进行了分析，这些样本分别取自患者接受SBRT治疗前和治疗后。通过基因表达谱分析，他们寻找那些在SBRT后表达量增加，并且与远处未照射转移灶进展呈正相关的基因。

结果出乎意料，在大量变化的基因中，表皮生长因子受体（EGFR）的配体——两性调节蛋白 Amphiregulin (AREG) 浮出水面。它不仅是放疗后表达显著增加的基因之一，并且其表达水平的变化与远处肿瘤的进展正相关。更令人担忧的是，研究发现，与放疗后AREG表达未增加的患者相比，AREG表达增加的患者，其无进展生存期（Progression-Free Survival, PFS）和总生存期（Overall Survival, OS）都显著缩短。

这个临床发现敲响了警钟：放疗诱导的AREG表达增加，可能就是导致远处转移灶进展、预后不良的关键因素。进一步分析肺鳞状细胞癌（LUSC）患者的TCGA公共数据库也印证了这一点：肿瘤AREG表达水平越高，患者预后越差。

小鼠模型追捕——是谁在偷偷“喂养”转移灶？

为了深入探究AREG在放疗后促进远处转移的机制，研究人员转向了小鼠模型。他们使用了路易斯肺癌（Lewis Lung Carcinoma, LLC）模型，这是一种会在小鼠体内自发转移到肺部的肿瘤。他们将LLC肿瘤细胞植入小鼠侧腹部，进行局部放疗（5、10或20 Gy）。

数据显示，这些LLC肿瘤对放疗剂量表现出高度抵抗性，肿瘤仍在生长。但有趣的是，即使20 Gy放疗确实减少了肺部转移灶的数量，10 Gy和20 Gy放疗都显著增加了肺部转移灶的平均大小，与未接受放疗的肿瘤相比，大小增加非常明显。

更关键的是，LLC侧腹肿瘤在放疗后，局部和全身的AREG浓度都出现了剂量依赖性增加，20 Gy时达到最高水平。而在未荷瘤的小鼠进行相同放疗时，AREG水平却没有增加，这强烈提示放疗诱导的AREG主要来源于肿瘤细胞。

研究人员还使用了Vav1^Areg基因敲除小鼠模型，这种小鼠在所有造血和内皮细胞谱系中都缺乏Areg表达。在这些小鼠身上，即使LLC肿瘤细胞存在，肿瘤来源的AREG减少或缺失，放疗诱导的转移灶增长现象也显著减弱或消失。这些小鼠实验结果与临床发现相互印证，表明肿瘤细胞在放疗后分泌的AREG，是介导远处转移灶增大的核心推手。

基因编辑显真身——拿掉AREG，转移就不“疯长”了！

为了直接验证肿瘤细胞来源的AREG是否是罪魁祸首，研究人员利用CRISPR-Cas9技术，在LLC细胞中敲除了Areg基因，获得了AREG缺陷型LLC细胞（LLCAR-）和相应的野生型对照细胞（LLCAR+）。

实验结果非常明确：与LLCAR+肿瘤不同，LLCAR-肿瘤在放疗后没有出现AREG的上调。最重要的是，LLCAR-肿瘤生长速度较慢，导致的肺部转移灶数量更少、体积更小，而且侧腹肿瘤放疗没有引起LLCAR-肺部转移灶大小的增加。这些结果在肺部原位肿瘤模型中也得到了重复。

类似的，研究人员也在一个会自发转移到肺部的乳腺癌细胞系（EO771-LMB）中进行了Areg基因敲除实验。结果同样显示，敲除Areg阻止了放疗诱导的Areg上调，显著延缓了侧腹肿瘤的生长，并且放疗相关的转移灶增长现象完全消失。

这些决定性的基因敲除实验，直接证明了肿瘤细胞来源的AREG是放疗引起远处转移灶增大的关键驱动因素。更进一步，当研究人员给LLCAR-小鼠注射重组AREG（rAREG）时，即使肿瘤本身缺乏Areg，外部补充的AREG也显著增加了LLCAR-肺部转移灶的大小，这进一步证实了AREG可以直接促进转移灶的生长。

AREG盯上免疫细胞，让它们“变节”？

既然确定了肿瘤来源的AREG是幕后黑手，它又是如何工作的呢？研究人员推测，AREG可能通过影响宿主的免疫反应来促进转移。AREG的一个重要功能是激活EGFR，并诱导其在特定位点（如酪氨酸992, Tyr992）发生磷酸化（p-EGFR）。

研究人员利用流式细胞术分析了NSCLC患者接受SBRT治疗后的外周血单核细胞（PBMCs）。他们发现在患者PBMCs中，Tyr992磷酸化的p-EGFR在单核细胞（Monocytes）和树突状细胞（Dendritic Cells）上的表达最高。而且，SBRT后p-EGFR+单核细胞的比例增加，与患者更差的整体生存率显著相关。

小鼠肺组织中的免疫细胞分析也得到了类似的结果。在荷LLCAR+肿瘤的小鼠肺部，p-EGFR+的单核吞噬细胞（Mononuclear Phagocytes, MNPs），特别是Ly6C+ MNPs，在放疗后显著增加，但在荷LLCAR-肿瘤的小鼠中则没有这个现象。利用人工智能辅助的细胞分割模型分析转移灶微环境也证实，放疗后转移灶区域的Ly6C+ MNPs数量显著增加。

这些发现提示，AREG可能通过靶向并影响以单核细胞和树突状细胞为主的EGFR+单核吞噬细胞（MNPs），来发挥其促进转移的功能。

AREG“收买”免疫细胞，让它们“吃不下”肿瘤！

为了理解AREG如何影响MNPs，研究人员对放疗后小鼠肺部的免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。他们对MNPs进行了亚群分析和细胞分化轨迹推断。

令人震惊的是，在LLCAR+小鼠接受20 Gy放疗后，MNPs的组成发生了显著变化，并且细胞分化被“阻滞”在了早期状态，更倾向于沿着一条“免疫抑制”轨迹发展，这条轨迹上的抗肿瘤功能基因（如涉及吞噬、抗原呈递的基因）表达下调，而免疫抑制基因表达上调。相比之下，在AREG缺陷的LLCAR-小鼠中，MNPs则更倾向于分化为具有促炎症、高吞噬和抗原呈递功能的亚群。

这表明，肿瘤细胞在放疗后分泌的AREG，“重编程”了MNPs，让它们从原本可能参与抗肿瘤免疫的角色，“变节”成了免疫抑制性的帮凶。

除了影响MNPs的分化方向，AREG是否还影响了它们直接杀死肿瘤细胞的能力？MNPs的一个重要功能是吞噬作用（Phagocytosis），即“吃掉”肿瘤细胞。研究人员进行了MNP与肿瘤细胞的共培养实验。

结果发现，骨髓来源的MNPs显著吞噬了更少的LLCAR+肿瘤细胞，而对LLCAR-肿瘤细胞的吞噬能力则强得多。这种吞噬能力的下降，与LLCAR+肿瘤细胞表面更高的CD47表达有关。CD47是一种著名的“别吃我”（Don't-Eat-Me）信号分子，免疫细胞表面的SIRPα蛋白识别到肿瘤细胞表面的CD47后，会抑制自身的吞噬活性。

研究进一步发现，放疗显著上调了LLCAR+肿瘤细胞表面的CD47，而这种上调在LLCAR-肿瘤细胞中则没有发生，这说明放疗诱导的CD47上调是AREG依赖性的。用重组AREG处理LLCAR-肿瘤细胞，能提高其CD47水平；而用AREG靶向抗体处理LLCAR+肿瘤细胞，则能降低CD47水平。AREG通过激活STAT3信号通路来上调CD47，而使用STAT3抑制剂可以阻断rAREG或放疗诱导的CD47上调。

因此，放疗诱导肿瘤细胞分泌AREG，不仅“收买”了MNPs，还通过提高肿瘤细胞表面的CD47水平，让这些免疫细胞“吃不下”肿瘤细胞，从而促进了肿瘤的逃逸和远处转移灶的增长。