PNAS：华中农业大学孙明/郑金水首次揭示DNA 6mA修饰调控根结线虫毒力，去甲基化酶为防控新靶点

解析控制病原体毒力基因表达的全局调控机制，对于阐明致病性的分子基础至关重要。N6-甲基腺嘌呤（6 mA）在反映各种环境因素胁迫的基因表达调控中起着关键作用；然而，其在病原体毒力中的作用在很大程度上仍未得到探索。

2026年3月4日，华中农业大学孙明和郑金水共同通讯在PNAS 在线发表题为“N6-methyladenine DNA modification modulates pathogen virulence in nematodes”的研究论文。该研究报道了6 mA在17个线虫分离株中的广泛存在，并绘制了六种重要农业病原体——根结线虫（RKNs）的基因组6 mA图谱。作者证实，6 mA在所有线虫中均以保守的GAG基序为特征，但表现出物种特异性的分布模式，并对基因表达产生不同的影响。值得注意的是，6 mA在转座元件（TEs）中的富集程度在多倍体与二倍体线虫之间存在差异，这提示了可能与多倍体相关的谱系特异性表观遗传调控。

作者进一步鉴定出两个功能性的6 mA去甲基化酶，MiNMAD-1和MiNMAD-2，并确认了它们的催化活性与活性位点。通过宿主诱导的基因沉默（HIGS）技术抑制minmad-1的表达，能显著增强植物对三种多倍体根结线虫物种的抗性。详细的功能分析表明，敲低minmad-1广泛影响了线虫寄生阶段的基因表达，其中包括参与毒力的基因，从而降低了线虫的侵染能力。综上所述，该研究结果表明，6 mA去甲基化酶是根结线虫毒力的关键表观遗传调控因子，这为理解线虫生物学提供了新的见解，并为开发可持续的防控策略提供了有潜力的靶点。

病原体毒力基因表达的调控对于理解致病机制至关重要。当前研究主要集中于单个毒力基因的功能分析，而对于病原体全局毒力调控的广泛机制仍知之甚少。DNA甲基化作为最早被发现的DNA修饰之一，能够影响染色质结构、DNA构象、稳定性及蛋白质交互作用，从而调控基因表达。6-甲基腺嘌呤（6 mA）在细菌毒力中的作用已较为明确。然而，在真核生物中，相关证据仍然有限，仅有少数研究报道了6 mA在真菌中调控毒力的现象。例如，6 mA甲基转移酶对于植物病原真菌寄生隐丛赤壳菌（Cryphonectria parasitica）的致病性至关重要。但大多数将6 mA与毒力联系起来的研究都集中于动物病原体，其在植物病原体中的作用在很大程度上仍未得到探索。此外，尽管功能研究主要集中于6 mA甲基转移酶，但去甲基化酶的作用仍鲜为人知。

近年来，DNA 6 mA修饰已在越来越多的真核生物中被报道，包括秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、果蝇（Drosophila）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、真菌、植物以及哺乳动物。在真核生物中，6 mA甲基化既发生在对称序列也发生在非对称序列中，且非对称6 mA在线虫中占主导地位。研究表明，真核生物的6 mA可通过半保留机制传递，并由DNA聚合酶整合入哺乳动物基因组。在功能上，6 mA与疾病发生、胚胎发育以及环境因素应激反应相关。作为一种关键的表观遗传调控因子，6 mA去甲基化酶影响着多种生物学过程，包括生殖、卵巢发育、DNA复制与修复、血管钙化以及神经发育。6 mA去甲基化酶在病原体感染中的作用也已在卢西塔诺毛霉（Mucor lusitanicus）中得到初步报道。然而，值得注意的是，一些研究报道了在培养细胞中存在6 mA，但后续证实所检测到的6 mA主要源于细菌DNA污染。因此，严格控制细菌污染对于准确检测真核生物中的6 mA至关重要。

模式机理图（图片源自PNAS ）

尽管如此，6 mA调控真核病原体寄生性的机制——尤其是去甲基化酶与毒力之间的联系——仍不清楚。植物寄生线虫（PPNs）每年造成的毁灭性农业损失估计超过1000亿美元。其中，根结线虫（RKNs）破坏性最强，因其广泛的寄主范围和复杂的倍性而日益受到关注。具有侵染性的二期幼虫（J2s）在根尖附近侵入寄主根部，在细胞间迁移，并在维管柱内建立巨型细胞。一系列多样化的线虫效应因子促进了巨型细胞的形成与维持。然而，这些效应基因的表观遗传调控在很大程度上仍未得到探索。先前对根结线虫表观遗传学的研究主要集中于组蛋白修饰和微小RNA（microRNA）。基于同源性的甲基转移酶和去甲基化酶分析表明，南方根结线虫（Meloidogyne incognita, Mi）缺乏DNA 6 mA修饰机制，这引发了关于6 mA是否存在于根结线虫基因组中的疑问。或者，这些酶可能与已知的同源物存在显著差异，值得进一步研究。

在本研究中，作者利用液相色谱-串联质谱联用技术（LC–MS/MS）检测了17个线虫分离株中6 mA的存在，并通过单分子实时测序（SMRT-seq）、N6-甲基腺嘌呤DNA免疫沉淀测序（6 mA-DIP-seq）以及DNA斑点印迹实验，证实了在两个二倍体（禾谷根结线虫Meloidogyne graminicola和北方根结线虫Meloidogyne hapla）、两个异源三倍体（南方根结线虫M. incognita和花生根结线虫三倍体Meloidogyne arenaria 3n）以及两个异源四倍体（花生根结线虫四倍体M. arenaria 4n和爪哇根结线虫Meloidogyne javanica）中存在DNA 6 mA修饰。作者发现6 mA富集于活跃转录的基因中，并且在不同的根结线虫物种中表现出独特的分布模式，尤其是在转座元件（TEs）内部，二倍体与多倍体根结线虫之间观察到了显著差异。

在南方根结线虫中，低甲基化位点集中于A2亚基因组，并与细胞功能关键基因相关，例如G蛋白偶联受体（GPCR）。重要的是，作者鉴定出两个推定的6 mA去甲基化酶（MiNMAD-1和MiNMAD-2），并通过结构预测和生化验证确定了它们的催化位点。值得注意的是，通过寄主诱导的基因沉默（HIGS）技术沉默minmad-1基因，显著增强了转基因寄主植物对三种多倍体根结线虫物种的抗性。进一步分析揭示，MiNMAD-1在调控基因表达（包括与毒力相关的基因）中发挥着全局性作用。综上所述，作者的研究结果在一种真核病原体中建立了表观遗传调控与毒力之间的直接联系。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2525035123