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基因表达动态示踪的新技术研究获进展

  1. 基因表达

来源:脑智卓越中心 2021-01-06 12:55

  Nature Cell Biology在线发表了研究论文《通过内源性启动子驱动的sgRNA监测低丰度转录本和lncRNAs的表达》,该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室研究员杨辉研究组和研究员周海波研究组合作完成。研究通过内源基因的启动子驱动sgRNA(si

 

 

Nature Cell Biology在线发表了研究论文《通过内源性启动子驱动的sgRNA监测低丰度转录本和lncRNAs的表达》,该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心(神经科学研究所)、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室研究员杨辉研究组和研究员周海波研究组合作完成。研究通过内源基因的启动子驱动sgRNA(single-guide RNAs)表达,结合SPH-OminiCMV(CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry)荧光报告系统,实现低丰度基因和lncRNAs(Long non-coding RNAs)基因表达的动态示踪,建立了一种通用的内源基因转录门控系统,为活细胞中实时标记低表达基因和lncRNAs,研究其生物学功能提供了有效工具。

在活细胞中实时监测内源基因活性对研究基因的生物学功能并调控其表达水平至关重要。近年来,越来越多研究表明,lncRNAs通过调控某些重要编码基因的表达,不仅参与了脑发育、神经元分化、突触可塑性的发生发展,而且参与了神经系统损伤之后的修复过程。深入研究lncRNAs,将为治疗神经系统疾病提供新思路。然而,受现有标记技术的限制,对其功能注释具有挑战性。

监测内源基因活性的常规方法是将荧光蛋白精确插入蛋白编码框中,但这种方法不适用于非编码基因和低丰度转录的基因。sgRNA,类似于一个GPS可以将Cas核酸酶直接导向目标核酸位点,具有高特异性、高效率和多功能性。尽管各种诱导性sgRNA已被开发用来接收活细胞中的内源信号,但这些方法只能用于某些功能明确的小RNA的反应。目前在活细胞里面标记内源基因表达的方法存在局限性,且对于低表达的基因以及lncRNA,缺乏很好的活细胞内的标记技术。建立适用范围更广、可增强内源信号、且信噪比更低的新型活细胞标记技术是该研究领域急需解决的问题。

杨辉研究组和周海波研究组合作开发了一种广谱的内源性转录门控开关Ents(Endogenous Transcription-Gated Switch),利用内源性启动子表达sgRNA前体,之后sgRNA前体上的tRNA序列可被内源的自剪切机制识别并且切割,进而释放出能够执行功能的sgRNA,当Ents与高度敏感的CRISPR激活相关的报告系统SPH-OminiCMV结合,可以监测到内源基因的表达(图A)。SPH-OminiCMV-Ents能够放大内源信号,从而实现低丰度转录本表达的可视化。

为进一步研究SPH-OminiCMV-Ents用于监测内源基因的能力,科研人员选取了表达量从高到低的八个基因,发现SPH-OminiCMV-Ents诱导的mCherry表达水平普遍高于常用的P2A-mCherry标记策略,尤其是P2A-mCherry策略标记后在荧光显微镜下几乎无信号的低丰度表达基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等(图B)。

为探讨增加sgRNA拷贝数是否会进一步增强荧光蛋白的产生,科研人员构建了一个sgRNA前体,包含六到八个串联的sgRNA拷贝,每个sgRNA的两侧分布着tRNA序列(图C)。研究表明,插入sgRNA阵列可以对低丰度基因实现更好的监测,比如lncRNA Tug1,当仅用一个拷贝的sgRNA的时候不能监测到其表达,但使用sgRNA阵列则可以(图D,E)。为进一步探讨此方法的特性,科研人员建立了一个可控的Tet-on系统,该系统可以通过调节Dox的浓度,实现EGFP基因不同程度的表达量,进而用来研究报告系统的荧光信号强度是否可以较好地反映目标基因的表达水平。研究发现,报告系统的mCherry表达量和EGFP基因的表达量有较强的相关性,并且进一步探索了此报告系统和目标基因表达在转录本水平和蛋白翻译水平存在的时间差(图F)。为探讨此系统是否能随着基因表达量的增高,其报告系统也能监测出信号增强的变化。科研人员选取了表达量在小鼠胚胎干细胞中表达量低,但体外分化成神经元后表达量会增高的Tubb3基因。研究表明,分化后Tubb3的基因表达量不管是mRNA还是蛋白水平的表达量均增高,报告系统中的红色荧光信号也随之增高,能够反映基因表达的动态变化。 (生物谷Bioon.com)

 

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