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Nat Biotechnol:将CRISPR/Cas9与纳米孔测序相结合实现靶向测序

来源:本站原创 2020-03-08 17:45

2020年3月8日讯/生物谷BIOON/---为了寻找对人类基因组进行测序并读取DNA关键变化的新方法,来自美国约翰霍普金斯大学医学院的研究人员在一项新的研究中成功地使用了基因切割工具CRISPR/Cas9在较长的肿瘤基因周围进行了DNA切割,以用于收集序列信息。他们在来自人类乳腺癌细胞和组织的基因组中进行概念验证实验。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation”。
外切酶测序示意图,图片来自Frontiers in Genetics, 2015, doi:10.3389/fgene.2014.00449。

这些研究人员表示,将CRISPR与对人类癌症组织的DNA成分进行测序的工具相结合有朝一日可能能够实现对患者肿瘤的快速、相对便宜的测序,从而简化针对高度特异性的个人基因改变的治疗方法的选择和使用。

论文通讯作者、约翰霍普金斯大学医学院生物医学工程助理教授、分子生物学与遗传学助理教授Winston Timp博士说,“对于癌症患者的肿瘤测序,你不一定需要对整个癌症基因组进行测序。对特定的遗传感兴趣区域进行深度测序可能非常有用。”

在常规的基因组测序中,科学家们必须制造出感兴趣的DNA的许多拷贝,将DNA随机断裂为多个片段,然后给一台计算机机器提供这些断裂的片段,这样就可读取由碱基A、C、G和T组成的核酸序列。然后,他们寻找这些断裂片段的重叠区域,并将它们像屋顶上的瓦片一样装配在一起,以形成构成一个基因的较长DNA区域。

在这些实验中,Timp和博士生Timothy Gilpatrick能够利用CRISPR对从乳腺癌患者的一小部分肿瘤组织中分离出来的DNA进行靶向切割,从而能够跳过常规测序的DNA复制部分。随后,他们将所谓的“测序接头(sequencing adaptor)”附着到DNA片段的CRISPR切割末端上。这些测序接头充当把手的作用,将DNA引导到读取其碱基序列的“纳米孔(nanopore)”中。通过让DNA穿过这个狭窄的纳米孔,测序仪可以根据每个化学代码(即碱基)滑过该孔时产生的独特电流来产生DNA碱基的读数。

在Timp团队关注的10个乳腺癌基因中,这些研究人员能够对乳腺癌细胞系和组织样品进行纳米孔测序,从而检测出一种称为甲基化的DNA改变。甲基化指的是甲基添加到基因周围的DNA上,从而影响基因的读取方式。

这些研究人员在一个称为角蛋白19(KRT19)的基因中发现了DNA甲基化下降的位置。先前的研究已表明KRT19中DNA甲基化的减少与肿瘤扩散有关。

在他们研究的乳腺癌细胞系中,Timp团队能够实现平均每个碱基对产生400个“读数”,这个读数的“深度”比某些常规测序工具好数百倍。在他们的活组织检检查中获得的人类乳腺癌肿瘤组织样本中,他们能够实现平均每个区域产生100个读数。Timp说,“这肯定比我们用细胞系所能做的要少,但是我们必须对人类组织样本中的DNA更加温和,这是因为它已经被冷冻和解冻了好多次。”

除了对DNA甲基化和较小突变进行研究外,Timp团队还对通常与乳腺癌相关的基因--- BRCA1,这个基因在基因组中的长度超过8万个碱基---进行了测序。Gilpatrick说,“这个基因确实很长,我们能够收集这个大而复杂的基因组区域的测序片段(sequencing reads)。”

Timp说:“鉴于我们能够使用这种技术对比较长的基因进行测序,因此我们也许能够捕获到缺失的较大的DNA片段,而这些都是我们无法用更常规的测序工具所能找到的。”

Timp说,除了可以为患者提供指导治疗的潜力外,CRISPR技术与纳米孔测序的结合提供了如此好的深度,以至于它可能帮助科学家们找到新的针对一个等位基因(遗传自父本或母本)而不是另一个等位基因的疾病相关基因改变。

Timp和Gilpatrick计划继续完善CRISPR/纳米孔测序技术,并将在其他肿瘤类型中测试它的功能。(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

1.Timothy Gilpatrick et al. Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation. Nature Biotechnology, 2020, doi:10.1038/s41587-020-0407-5.

2.CRISPR gene cuts may offer new way to chart human genome
https://phys.org/news/2020-02-crispr-gene-human-genome.html
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