《自然·癌症》：发现抗CTLA-4抗体全新机制！揭秘单抗“第三只手”的抗肿瘤秘诀

免疫检查点阻断（ICB）给癌症治疗带来了新的希望。其中，CTLA-4是经典的免疫检查点，它可以通过抑制CD80或CD86与共刺激受体CD28的结合来抑制T细胞活性[1]。靶向CTLA-4的单克隆抗体广泛应用于临床治疗，但可惜的是，只有小部分病人能从中获益[2]。

抗CTLA-4抗体的Fc端与Fc受体（FcγRs）结合诱导的抗肿瘤作用是近年来的研究热点。有研究表明，抗CTLA-4抗体不仅可以激活细胞毒性T细胞，还可以通过结合FcγRs促进肿瘤浸润调节性T细胞（Treg）耗竭[3-4]。不过有关于FcγR结合对抗CTLA-4抗体驱动的抗肿瘤活力的贡献仍存在很大的争议。

近日，以色列雷霍沃特的魏茨曼科学研究所的Sergio A. Quezada教授和伦敦大学学院癌症研究所的Ido Amit 教授强强联合揭开了这一谜题，该成果发表在著名期刊Nature Cancer上。

研究团队利用大量的单细胞测序（sc-RNAseq）揭示了，具有较强FcγR结合能力的抗CTLA-4抗体可以抑制肿瘤生长和驱动免疫重塑，这不仅是由Treg耗竭和CTLA-4阻断导致的，而且是由FcγR结合和I 型干扰素导致的。

接下来就让我们看看这项研究是如何展开的。

首先，在MCA-205（纤维肉瘤）和MC38（结肠癌）的荷瘤小鼠中，研究团队分别给予它们CTLA-4 mIgG1（CTLA-4 m1）抗体和CTLA-4 mIgG2a（CTLA-4 m2a）抗体治疗。与CTLA-4 m1抗体相比，CTLA-4 m2a抗体具有更强的FcγR结合能力。实验结果表明，与对照组（未治疗组）和CTLA-4 m1抗体相比，CTLA-4 m2a抗体可以显著抑制MCA-205和MC38肿瘤的生长。

那么CTLA-4 m2a抗体是如何影响肿瘤微环境（TME）的呢？

研究团队利用scRNA-seq分析了治疗第8天的小鼠MCA-205肿瘤的免疫细胞组成。Ido团队通过无监督细胞聚类分析鉴定了不同的免疫细胞亚群，其中包括Treg、免疫抑制性髓系细胞（Arg⁺肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、Arg⁺单核细胞）、表达IFN信号通路相关基因的炎症性髓系细胞（Ifit1⁺TAM、Ifit1⁺单核细胞）等。

分析结果还显示，CTLA-4 m1抗体治疗组的肿瘤浸润免疫细胞组成与对照组相似，而CTLA-4 m2a抗体治疗驱动了多种免疫细胞亚群的重塑。在淋巴细胞组成中，高表达ctla4的Treg细胞被耗竭了。除此之外，髓系细胞组成也发生了显著变化，单核细胞/TAM比例增加、Arg⁺单核细胞/Ifit1⁺单核细胞、Arg⁺TAM/Ifit1⁺TAM比例增加以及中性粒细胞比例增加等。

CTLA-4 m2a抗体可以抑制肿瘤生长和驱动免疫重塑

但是，这些免疫重塑包含了抗CTLA-4抗体对TME的直接和间接作用。为了更好地研究抗CTLA-4抗体的直接作用，Ido团队利用scRNA-seq分析了治疗第1天的小鼠MCA-205肿瘤的免疫细胞组成。

令人惊喜的是，在治疗第1天，抗CTLA-4 m2a抗体也可以同时驱动淋巴细胞和髓系细胞的免疫重塑。但这与第八天略有不同，主要表现中性粒细胞的比例没有显著变化，而炎症性单核细胞/免疫抑制性单核细胞、炎症性TAM/免疫抑制性TAM比例增加。除此之外，基因集富集分析（GSEA）的结果表明，在抗CTLA-4 m2a抗体治疗组中，IFN信号通路相关的基因在髓系细胞上高表达。而抗CTLA-4 m1抗体对小鼠TME没有显著影响。

上述数据表明， 抗CTLA-4 m2a抗体通过诱导Treg细胞耗竭和髓系细胞重编程促使TME向促炎和活化的状态转换。

CTLA-4 m2a抗体可以驱动快速的免疫重塑

研究人员推测，FcγR可能在抗CTLA-4 m2a抗体驱动的免疫重塑中起到了重要作用。因此，他们使用了转基因小鼠进一步研究了FcγR的作用机制。在Foxp3^DTR小鼠中，他们利用白喉毒素（DT）诱导了MCA205肿瘤浸润Treg细胞耗竭。与抗CTLA-4 m2a抗体相比，白喉毒素虽然能诱导Treg细胞耗竭，但不能抑制MCA205肿瘤生长，也不能驱动髓系细胞重编程。差异基因表达（DEG）的分析结果表明，与抗CTLA-4 m2a抗体治疗组相比，DT治疗组中差异表达的基因非常少，并且都与I型IFN信号通路无关。此外，如果敲除小鼠的FcγR基因（Fcgr KO小鼠），抗CTLA-4 m2a抗体也不能抑制其肿瘤生长和驱动髓系细胞重编程。

也就是说，在抗CTLA-4 m2a抗体治疗后，FcγR结合在驱动髓系细胞重编程和I型IFN信号通路中起到了重要作用。

FcγR结合在CTLA-4 m2a抗体驱动的髓系细胞重编程中起到了重要作用

为了单独研究在抗CTLA-4 m2a抗体治疗后FcγR对髓系细胞重编程的影响，研究人员进行了一系列体外实验，首先，他们将小鼠脾脏的Treg细胞与骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）进行共培养。BMDM分别来自野生型（WT）、Fcgr KO和IFNα受体（Ifnar） KO小鼠。此外，他们还将Treg细胞和BMDM与抗CTLA-4 m1抗体、抗CTLA-4 m2a抗体和对照的培养基分别进行共培养，并对分选出的BMDM进行scRNA-seq。 

研究发现，体外培养实验的结果与小鼠体内实验的结果一致。在野生型小鼠中，与对照和抗CTLA-4 m1抗体治疗组相比，在抗CTLA-4 m2a抗体治疗组中，虽然Treg细胞没有耗竭，但髓系细胞还是发生了重编程。例如炎症性BMDM/免疫抑制性BMDM细胞的比例增加，IFN信号通路相关的基因（Isg20、Irf7和Ifit1）表达上调。这表明FcγR驱动的髓系细胞重编程与Treg细胞耗竭互相独立。

此外，与野生型小鼠相比，Fcgr KO和Ifnar KO小鼠中IFN信号通路相关的基因表达下调，并且抗CTLA-4 m2a抗体也不能抑制Ifnar KO小鼠肿瘤的生长。

上述结果表明，髓系细胞FcγR的结合和I型IFN信号对于抗CTLA-4 m2a抗体的抗肿瘤免疫反应至关重要。

髓系细胞FcγR的结合和I型IFN信号在CTLA-4 m2a抗体的抗肿瘤免疫反应中起到了重要作用

总的来说，该项研究通过大量的单细胞测序和小鼠实验揭示了FcγR结合是抗CTLA-4抗体的抗肿瘤新机制，并且展现了开发具有更强FcγR结合能力的抗CTLA-4抗体的巨大前景。 

不过本篇文章还停留在临床前研究的阶段。新的抗CTLA-4抗体的开发和应用仍旧任重而道远。在未来，就让我们期待进一步的临床试验探索新的抗CTLA-4抗体的效果，为众多的癌症患者带来新的希望。

此外，举一反三，FcγR结合与其他免疫治疗的联合是否也有更强的抗肿瘤能力也值得期待！

参考文献：

[1] Walker LS, Sansom DM. Confusing signals: recent progress in CTLA-4 biology. Trends Immunol. 2015;36(2):63-70. doi:10.1016/j.it.2014.12.001

[2] Weiss SA, Wolchok JD, Sznol M. Immunotherapy of Melanoma: Facts and Hopes. Clin Cancer Res. 2019;25(17):5191-5201. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-1550

[3] Simpson TR, Li F, Montalvo-Ortiz W, et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma. J Exp Med. 2013;210(9):1695-1710. doi:10.1084/jem.20130579

[4] Arce Vargas F, Furness AJS, Litchfield K, et al. Fc Effector Function Contributes to the Activity of Human Anti-CTLA-4 Antibodies. Cancer Cell. 2018;33(4):649-663.e4. doi:10.1016/j.ccell.2018.02.010