《Science Advances》新发布! 单细胞蛋白组技术验证CD73为新的癌症治疗靶点

癌症研究中方兴未艾的免疫治疗的思路主要包括免疫检查点治疗和细胞治疗。这两种思路是从提高免疫细胞功能的角度出发，为患者输注药物去增加免疫力。能不能从相反的角度出发，对于一些影响免疫力的蛋白做一些“减法”治疗，即去除这些蛋白。这种药物研发在之前是难以实现的，或者说是“难以成药” 。但随着一些新的药物研发策略的兴起，使这些蛋白有望成为新的靶点。

南京医科大学附属第一医院肿瘤内科殷咏梅副院长团队成员与西北大学芬伯格医学院罗伯特·卢里综合癌症中心的研究者刚刚在《Science Advances》杂志上发表了一篇题为“Proteolytic Regulation of CD73 Orchestrates Tumor Immunogenicity”（调控CD73的蛋白水解可调节肿瘤免疫原性）的论文给出了新的肿瘤治疗思路。文章提到，乳腺癌是导致妇女癌症死亡的第二大原因，对于女性的健康造成很大的威胁。其中三阴性乳腺癌（TNBC）被认为是一种“冷肿瘤”，对其治疗选择较少，也是最具侵袭性的乳腺癌形式，导致患者预后不良。在乳腺癌治疗靶点的选择上，除了免疫检查点外，还存在CD73这类与肿瘤微环境免疫功能相关的蛋白。高水平的CD73与较差的预后相对应。与此同时，三结构域（TRIM）蛋白也与免疫调节和肿瘤发生有关。TRIM蛋白本质上是蛋白质降解途径的一部分，在其中它们发出某些蛋白质的降解信号。先前的研究表明，TRIM21水平与疾病进展相对应，但迄今为止，它与癌症免疫原性的关联仍不清楚。

图1：TRIM21low/CD73high的特征与不利的免疫反应相关

研究思路

研究者证实了CD73的高表达与所有乳腺癌分类中较低的生存率相关。然后，他们通过一些分子生物学技术揭示了CD73水平经历了一种被称为泛素化的翻译后修饰。泛素化本质上是蛋白质的一种降解信号。通过分子生物学技术和质谱技术的结合发现这种蛋白水解信号的驱动因素是TRIM21。接下来，鉴定TRIM21作为控制CD73蛋白降解以调节T细胞功能的潜在泛素E3连接酶。

泛素化的关键是泛素肽附着（或连接）到赖氨酸残基上。该小组试图找出哪些赖氨酸残基可能是CD73蛋白被泛素化的赖氨酸。他们鉴定了以下赖氨酸作为泛素化位点：K133、K208、K262和K321。为了确定这些赖氨酸对TRIM21介导的CD73降解的重要性，作者将这些特定残基突变为精氨酸，理论上会阻断泛素化，得到多个突变TNBC细胞系：MDA-MB468-CD734KR（这4个赖氨酸残基均突变为精氨酸），MDA-MB468-CD73K133R/K208R（K133和K208的赖氨酸突变为精氨酸），MDA-MB468-CD73K262R/K321R（赖氨酸K262和K321突变为精氨酸）。

IsoPlexis检测方法

将MDA-MB468-CD73WT或MDA-MB468-CD734KR分别用APCP（CD73抑制剂）或不加APCP处理24小时，使用肿瘤条件培养基培养。收集突变TNBC细胞培养上清液。供体PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培养WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四组细胞。在孵育72小时后，作者评估了供体PBMC分选的CD8+T细胞的多功能性和细胞多功能指数PSI。

研究者发现，与WT细胞的T细胞相比，加入突变细胞系培养上清的T细胞多功能和多功能指数总体耗尽。并且有趣的是，与未经APCP处理的T细胞相比，经APCP处理的T细胞的多功能性和PSI似乎略有增加（图2）。

图2：IsoPlexis检测CD73及其泛素化位点突变对于免疫细胞功能的影响

这意味着靶向CD73，通过增强其降解或简单抑制其功能可能是增强免疫功能的可行选择。他们也进行了进一步检测以明确起关键作用的泛素化位点，培养MDA-MB468-CD73K133R/K208R和MDA-MB468-CD73K262R/K321R（图3），评估其培养上清对于CD8+T细胞多功能和PSI的影响，结果显示，K262和K321突变组的细胞多功能性和PSI均显著降低，表明K262和K321是TRIM21介导CD73泛素化降解的关键赖氨酸位点。

图3：IsoPlexis检测确定起关键作用的泛素化位点

此外，研究发现，当用IFNɣ处理MDA-MB468细胞时，TRIM21水平显著升高，CD73水平显著降低。这表明，像CD8+T细胞这样的IFNɣ分泌细胞的存在创造了一个反馈回路，从而提高肿瘤细胞中的TRIM21水平，进而耗尽CD73水平。最后，本文总结了小鼠和患者的体内数据，探讨了TRIM21水平如何与小鼠模型肿瘤负荷和患者更有利的免疫信号相关。总之，作者阐明了CD73如何促进TNBC的免疫逃避的机制，同时也揭示了CD73可以通过TRIM21进行调控的机制。最终，这些数据为靶向CD73以提高免疫疗法和其他类型的治疗方法的有效性提供了一个案例。

文章点评

在免疫检查点治疗策略之外，对付癌症的“武器库”永远需要新的选项，评估这些选项的标准是什么？是用了很多年的检测方式，还是研究人员比较“熟悉”的一些诸如浓度、成像、亚群等指标，抑或是“其他人”也在做的实验方法。我们认为答案是否定的，需要用事实说话，临床转化研究中的事实就是能否与临床结果建立相关性，这也是单细胞蛋白组技术对于临床转化及前期基础研究的意义。

IsoPlexis平台提供了评估免疫功能的标准，从而更好地确定治疗策略是否有效，如为CD73等新靶点评估提供决定性的根据。

与免疫检查点和细胞治疗不同，新的泛素依赖的药物研发路径使之前“难以成药”的蛋白成为新的靶点。要评估蛋白对于免疫微环境的影响，需要去检测免疫细胞的免疫功能的变化，需要对于活的免疫细胞进行刺激，并且避免由于免疫细胞的功能异质性而隐藏的重要信息，所以需要使用单细胞层面的功能蛋白组检测，这使得单细胞功能蛋白组技术成为这类研究的不二之选！