Cell论文：万级病毒ORF文库“全景扫描”——从12000个基因中揪出大批未知免疫调控蛋白

病毒性病原体对全球构成重大威胁——仅在上个世纪，人类就经历了多次大流行。现代社会的互联互通使得一次人畜共患传播即可迅速蔓延；而与此同时，由于人类与自然互动方式的改变，病毒向人类传播的风险正在上升。虽然外溢至人类的动物病毒通常与已知的人类病原体相关，但动物病毒多样性极为丰富，其中一些与人类同源病毒差异显著，原则上它们有可能演化出感染人类并在人群中传播的能力。

人类病毒组涵盖26个病毒科，其中20个已知可导致人类疾病，疾病范围从急性感染到慢性感染不等。病毒学研究往往聚焦于重点病原体或代表性的“原型”/模型病原体，单个实验室通常只研究一种病毒或一个病毒科。这种模式导致大量病毒病原体（包括潜在新兴威胁）及其组成蛋白未被充分研究。了解这些病毒组分的功能，对于识别那些已演化出与潜在宿主足够分子兼容性（从而能进入细胞并进行复制）的病毒，以及制定应对措施，至关重要。而这种分子兼容性的一个关键方面，便是病毒抑制宿主先天性和适应性免疫应答的能力。

此前对病毒开放阅读框（vORF）进行遗传筛选的工作，主要使用单个病毒/病毒科的ORF文库，或通过计算预测具有特定表型的ORF集合。这些方法虽有用，但大部分人类致病病毒组未被探测；成本高昂；而且在多数情况下无法对演化相关的病毒ORF进行比较。然而，基因合成技术的进步使得大规模合成基因文库的构建成为可能。

在一项新的研究中，研究团队开发了一个覆盖已知人类和动物病毒组多样性的vORF文库，以实现对病毒蛋白功能的系统分析。他们利用这一病毒ORFeome，鉴定了大量此前未知的细胞过程调控因子，包括超过700个调控细胞增殖、MHC-I类抗原呈递和干扰素（IFN）信号通路的病毒蛋白。对特定调控因子的深入表征发现：传染性软疣病毒（MCV）蛋白MC162R可招募多种宿主E3连接酶来降解MHC-I类分子；而亚巴样疾病病毒（YLDV）151R蛋白则是首个被鉴定为抑制IRF9功能的痘病毒蛋白，可选择性抑制IFN-β信号。

他们的结果表明，大量调控哺乳动物细胞过程并可能参与致病性的病毒蛋白仍未被表征。此外，通过跨病毒组演化空间的探测，他们发现了具有不同表型的相关病毒蛋白，凸显了病毒蛋白的持续演化。理解这些病毒蛋白的功能，可能为病毒操控宿主细胞过程的机制提供新见解。未来的病毒ORFeome筛选将使大规模发现影响多种细胞过程的病毒蛋白成为可能，并为系统生物学层面全面表征病毒组蛋白功能奠定基础，从而为已知人类病原体和具有大流行潜力的新兴病毒带来新认知。

病毒ORF文库的构建与系统级应用

构建病毒ORF文库并将其用于解析病毒对宿主细胞通路的调控，代表了一种理解宿主-病毒相互作用的系统性方法。虽然传统的遗传学和生物化学方法已为病毒蛋白功能提供了关键见解，但它们往往无法捕捉病毒组的全部多样性。同样，其他从病毒组中收集vORF的工作，通常集中于具有预测表型的ORF子集、优先考虑部分重点病原体，或未设计支持稳健多路复用筛选的功能（如多样化条形码、便于C端融合的终止密码子去除、简易亚克隆机制、T7体外翻译等）。此外，商业化的病毒ORF收集对于大规模应用而言成本过高，且局限于较少的病毒病原体。

本病毒ORF文库的规模和多样性——最初包含来自500多种病毒的约12,000个vORF（近期已扩展至约13,400个），覆盖了已知哺乳动物病毒蛋白质组的大部分。这一规模，加上载体设计的灵活性，使其尤为强大：通过多路遗传筛选，可识别功能上保守或分化的vORF同源物，从而为所鉴定的基因提供广阔的演化视角。

大量未知功能蛋白浮出水面

该病毒ORFeome包含了许多研究不足的病毒物种，使得他们能够表征此前功能或同源性未知的vORF。他们针对细胞增殖的初步筛选显示，大多数病毒ORF具有有害活性，这与病毒在劫持宿主关键过程的同时扰乱它们的事实一致。引人注目的是，他们观察到强烈的细胞类型特异性，反映了病毒对不同细胞环境的适应性，这也可能与其多样的病毒嗜性相关。例如，HIV主要存在于CD4⁺ T细胞中，遗传学研究表明其复制适应性依赖于CD4⁺ T细胞中表达的基因。他们注意到，每个毒性病毒相互作用都代表一个潜在的治疗靶点，可用于阻断病毒功能并恢复正常的细胞活性。

他们对抗原呈递和IFN刺激的检测，揭示了病毒为逃避免疫系统而承受演化压力的核心功能。几个关键发现如下：第一，他们鉴定出许多已知的上述通路调控因子，验证了他们高通量筛选方法的稳健性；第二，他们发现了大量此前未知的调控因子，其中许多来自研究不足的病毒；第三，通过序列相似性搜索，他们证明演化相关的蛋白具有相似表型，进一步强化了该文库方法的优势；第四，虽然大多数蛋白被注释有特定功能，但许多还表现出额外的不同活性。这突显了病毒蛋白表面在演化中被塑造成执行多种不同功能，从而在有限的蛋白质组空间内最大化功能。

免疫逃逸的新机制与新视角

通过降低适应性免疫系统的检测来实现免疫逃逸，可通过多种机制发生，但许多问题仍未解决。例如，MC162R似乎能识别大多数HLA分子；目前尚不清楚它是作用于质膜、内质网定位的HLA，还是两者皆有。他们也不知道它如何精确识别MHC-I类分子——可能是通过β2M或不同HLA蛋白的共同区域。此外，蛋白质组学分析提示MC162R还可能降低其他多种蛋白的水平，包括SPRY4、CALR和TFRC等。这些相互作用对病毒功能的意义仍有待确定。

IFN信号作为病毒复制的屏障，也常被病毒靶向。他们发现了118个候选病毒蛋白可特异性抑制IFN-β和/或IFN-γ信号。其中超过60个vORF此前未被报道与IFN拮抗相关。他们聚焦于相对研究不足的Yatapoxvirus属中的两个痘病毒vORF——YLDV 151R和YMTV 151R，两者均特异性削弱IFN-β信号。

有趣的是，MC162R和YLDV 151R均属于痘病毒科，但均不在研究较为透彻的正痘病毒属内。因此，病毒组范围的vORF研究为从非重点病原体物种中鉴定病毒基因提供了独特机会——这些物种虽未被列为重点病原体，却能影响人类蛋白功能。这些来自研究不足物种的病毒蛋白，可以是已表征病毒蛋白的序列和结构同源物但功能上发生分化（如YLDV 151R），也可以具有全新功能（如MC162R）。这些功能之所以重要，是因为同一病毒科内的病毒可交换遗传物质（如通过重组或重配），可能将来自研究较少病毒的基因转移给人类病原体。 同样，主要存在于动物中但能操控人类免疫的病毒，也可能对人类健康构成人畜共患威胁。

文库的广泛应用与未来方向

该文库的用途远不止于单vORF功能筛选。未来应用应包括全面的蛋白质组学和转录组学分析，以绘制vORF相互作用组图谱并阐明其对细胞生理的全局影响，从而指导对病毒-宿主相互作用的系统级理解。尽管不完美，但这一标准化、灵活的病毒ORFeome资源将为学界提供功能见解、促进工具开发、推动新研究方向以解读病毒机制和脆弱性，从而降低实验门槛，加快科学家探索病毒蛋白功能的新方向。

研究局限性

尽管用途广泛，病毒ORF文库仍存在若干局限。它需要随着新病毒基因的发现而不断更新。此外，基因合成和慢病毒递送的技术限制使得非常大的蛋白难以纳入。由于本方法逐一检测病毒蛋白，它能提供机制见解，但可能遗漏依赖于多蛋白复合物的功能。因此，该文库应被视为一个不断演进的资源，将随时间推移而改善。其他局限包括：许多所包含病毒缺乏稳健的细胞培养或反向遗传学系统；所使用的表达系统可能无法直接反映病毒感染期间观察到的表达水平。尽管如此，这些限制并不削弱vORF作为探测宿主通路或识别已演化出操控细胞过程能力的病毒蛋白的工具价值。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Eric Fujimura et al, A viral ORFeome library for systems-level genetic dissection of host-pathogen interactions, Cell (2026). DOI: 10.1016/j.cell.2026.05.024.