2021年11月CRISPR/Cas研究进展

2021年11月30日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。2020年10月，德国马克斯-普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士因在CRISPR-Cas9基因编辑方面做了的贡献荣获2020年诺贝尔化学奖。

CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。

2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。

即将过去的11月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。

1.Nat Commun：利用CRISPR/dCas9靶向阻断DNA甲基转移酶，可揭示特定启动子上DNA去甲基化的功能作用
doi:10.1038/s41467-021-25991-9

在一项新的研究中，来自加拿大麦吉尔大学的研究人员展示了他们如何通过使用CRISPR/dCas9基因组编辑技术，在体外培养的小鼠和人类细胞中成功地去除特定基因的DNA甲基化。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9”。

在体外，利用CRISPR/dCas9阻断DNA甲基转移酶，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-25991-9。

具体而言，这些作者优化了一种基于CRISPR/dCas9的无酶甲基化定向编辑系统，并发现表明该系统能够通过对DNA甲基转移酶活性进行立体干扰实现体外的选择性甲基化和细胞内的被动去甲基化。他们绘制了干扰区域的大小，优化了这种编辑系统，使作为靶标的CpG几乎完全去甲基化，而没有可检测到的脱靶效应，并分析了几个人类和小鼠基因中遗传上不同区域去甲基化的转录后果。在此过程中，他们提供了证据，表明近端启动子上的DNA去甲基化在某些情况下会增加基因的表达，但在其他情况下不会，这在不同程度上取决于基因组背景，而且DNA去甲基化可能促进对其他因子的反应。

2.Cell Rep：利用装载CRISPR的病毒来感染肠道菌群或能阐明微生物组基因编辑的潜能
doi:10.1016/j.celrep.2021.109930

对人类微生物组在疾病易感性和疾病疗法中作用机理的研究，由于缺乏从复杂群体中精确添加或移除微生物菌株或基因的方法而受到了一定的限制。近日，一篇发表在国际杂志Cell Reports上题为“Phage-delivered CRISPR-Cas9 for strain-specific depletion and genomic deletions in the gut microbiome”的研究报告中，来自加利福尼亚大学等机构的科学家们通过研究成功利用DNA编辑系统—CRISPR改变了生活在哺乳动物肠道中细菌的基因组，这一进展或代表了科学家们理解微生物组的研究进展，最终有望帮助开发治疗肠道相关疾病的新型疗法。

在这篇具有里程碑意义的研究中，研究人员从生活在小鼠肠道中的大肠埃希氏菌中移除了大块的基因，同时还改变了其消化系统中细菌群落的整体组成；研究者Peter Turnbaugh博士指出，我们已经证明了能在哺乳动物的肠道微生物组中进行首个稳定的基因编辑，而这或许是尝试对肠道内细菌进行工程化改造的起点。

3.Cancer Res：科学家发现CRISPR基因编辑技术和突变癌细胞之间新型关联
doi:10.1158/0008-5472.CAN-21-1692

p53是一种能保护细胞免于DNA损伤的特殊蛋白，在利用CRISPR技术进行基因编辑时其能被激活；而失活的p53突变是癌症中最丰富的遗传改变，携带突变p53的细胞往往拥有一定的生存优势，其最终可能会导致癌症发生。近日，一篇发表在国际杂志Cancer Research上题为“CRISPR/Cas9-induced DNA damage enriches for mutations in a p53-linked interactome： implications for CRISPR-based therapies”的研究报告中，来自瑞典卡罗琳学院等机构的科学家们通过研究发现了CRISPR、p53和其它癌基因之间的新型关联，这或许能在不影响“基因魔剪”有效性的情况下有效预防突变细胞的积累，相关研究结果或为后期科学家们进一步在精准医学研究做出成绩提供了新的思路。

如今研究人员已经知道，当p53处于活性状态时，CRISPR技术的效果往往较差，但与此同时，缺少p53会让细胞开始失控生长并发生癌变；在一半以上的癌症类型中，p53的基因都会发生突变并且无法保护细胞抵御失控的分裂，因此避免这种突变细胞的积累就变得非常重要了。这篇文章中，研究人员发现，当应用CRISPR技术时，携带p53失活突变的细胞就会获得一种生存优势，同时其也能在混合的细胞群中不断积累。此外，研究人员还识别出了一种能将基因与对p53突变有相似效应的突变相关联的一种特殊网络，而且他们发现，短暂地抑制p53或许是一种可能性的药物性策略来预防携带此类突变的细胞发生富集。

研究者Long Jiang表示，在CRISPR背景下抑制p53似乎是矛盾的，然而有些研究报道支持这一观点，即p53的抑制会让CRISRP技术变得更加有效；本文中，研究者也发现这或许能够抵消p53和一些相关基因发生突变的细胞发生富集或积累。本文研究对于未来CRISPR技术的临床应用具有一定的促进作用，因为研究者识别出了一种可能性的候选基因网络，当对细胞应用CRISPR技术时就需要严格控制细胞中所出现的突变。另一种可能性的结论就是，短暂抑制p53或许能作为一种减少突变细胞富集的新型策略。研究者还指出，DNA损伤反应或许能作为开发更加精确的导向RNA序列的一种可能性的标志，该序列或能被用来揭示CRISPR技术所要改变的DNA序列的位点。

4.Nat Commun：开发出优化碱基编辑器的新策略
doi:10.1038/s41467-021-26789-5

在一项新的研究中，来自美国莱斯大学的研究人员试图通过提前微调CRISPR碱基编辑策略来避免基因编辑错误。他们将理论和实验结合起来开发出一种构建更好的碱基编辑器的综合方法，其中碱基编辑器在单碱基分辨率下靶向修复有问题的DNA。相关研究结果近期发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“A general theoretical framework to design base editors with reduced bystander effects”。论文通讯作者为莱斯大学化学与生物分子工程师Xue Sherry Gao和化学家Anatoly Kolomeisky。

A3A-BE3 在EGFP位点1进行编辑的化学动力学模型，图片来自Nature Communications, 2021, doi:10.1038/s41467-021-26789-5。

这篇论文描述了碱基编辑器用来操纵DNA链的分子过程：在必要的地方切割DNA，为核苷酸替换让路。当它起作用时，正如它在治疗镰刀型细胞贫血和一些癌症等遗传疾病时越来越多地起作用一样，碱基编辑器仅编辑给定的核苷酸。当它不奏效时，那是因为不想要的编辑---也称为旁观者编辑（bystander edit）---会造成不希望看到的结果，即旁观者效应（bystander effect）。

5.Nat Biotechnol：利用基于CRISPR的方法揭示人类巨细胞病毒的致命弱点
doi:10.1038/s41587-021-01059-3

许多人---大约一半的成年人---都感染了一种叫做人类巨细胞病毒（HCMV的疱疹病毒。尽管大多数情况下没有症状，但该病毒对免疫力低下的人和未出生的婴儿来说是危险的。由于HCMV如此广泛存在，婴儿在子宫内被感染的几率大约是200分之一，而这种感染可能导致婴儿的大脑、肺部和生长出现问题。

在一项新的研究中，美国怀特黑德生物医学研究所成员Jonathan Weissman及其团队将前沿的CRISPR和单细胞测序技术用于这种病毒，迄今为止最详细地描述病毒和人类基因如何相互作用以形成HCMV感染，并揭示了通过操纵病毒和宿主基因有可能破坏这种病毒感染进展的新方法。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Functional single-cell genomics of human cytomegalovirus infection”。

这篇论文可能为未来的宿主-病原体相互作用的研究提供一个重要的路线图，并为抗病毒药物设计提供参考。在这个项目过程中，这些作者列出了一份病毒和宿主基因的清单，这些基因要么是HCMV复制所必需的，要么可能被操纵以赋予宿主细胞一些免疫力。论文第一作者、Weissman实验室前博士后研究员Marco Hein说，“如今我们就有了一个潜在的靶标清单，人们现在可以去开发靶向这些靶标的药物。”

6.Nature：利用CRISPR筛选揭示T细胞的营养物感应机制，提供了一种新的治疗视角
doi:10.1038/s41586-021-04109-7

激活免疫系统与感染或癌症作斗争，不仅仅取决于检测到威胁。免疫系统还必须检测它的细胞是否有足够的营养物来促进免疫反应。在一项新的研究中，来自美国圣犹大儿童研究医院的研究人员鉴定出构成调节性T细胞（Treg）营养物感应机制的生物开关。识别这些酶组分（即生物开关）仅是绘制和理解T细胞调节网络中营养物感应机制的开始。相关研究结果于2021年11月18日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“CRISPR screens unveil signal hubs for nutrient licensing of T cell immunity”。

两轮混合CRISPR筛选以识别新的营养物和mTORC1信号调节因子，图片来自Nature, 2021, doi:10.1038/s41586-021-04109-7。

mTORC1是细胞营养物感应机制中的一个关键酶开关。在这项新的研究中，这些作者试图确定将mTORC1与免疫系统功能联系起来的调节因子。他们使用全基因组CRISPR筛选来确定Treg细胞中编码这些调节因子的基因。这个过程就像从一堆不同的拼图中挑出关键的拼图块。他们利用CRISPR技术靶向小鼠基因组中大约2万个基因中的每一个，筛选了在上调或下调mTORC1活性的条件下被激活的Treg细胞。他们随后确定了几十个激活或失活mTORC1的基因。这些发现包括一些以前未知的调节因子。

SEC31A被确定为通过与GATOR2组分SEC13相互作用来促进mTORC1的激活，从而让它不受SKP1依赖的蛋白酶体降解的影响。因此，SEC31A的缺失会损害小鼠的T细胞激活和Treg细胞的抑制功能。此外，SWI/SNF复合物限制了氨基酸传感蛋白CASTOR1的表达，从而增强了mTORC1的激活。

7.Nat Commun：谨慎使用！基于CRISPR基因编辑技术的疗法或会产生携带致癌突变的细胞！
doi:10.1038/s41467-021-26788-6

最近有研究表明，通过CRISPR–Cas9进行基因组编辑或会在原代细胞中诱导p53所介导的DNA损伤反应，从而阻碍细胞的生长，这或许就会导致对已经存在的p53突变的细胞的选择。近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“A systematic genome-wide mapping of oncogenic mutation selection during CRISPR-Cas9 genome editing”的研究报告中，来自美国国立卫生研究院等机构的科学家们通过研究发现，基于CRISPR -Cas9的基因编辑（尤其是基因敲除）或许会让细胞产生于癌症相关的基因突变形式，这些研究发现强调了对接受基于CRISPR -Cas9的基因编辑疗法来修饰癌症相关基因突变患者及时监测的必要性。

CRISPR-Cas9的工作原理是在DNA序列的特定位点上产生双链DNA断裂，从而就能使得科学家们靶向作用并编辑特定的基因，然而，p53基因能通过抑制细胞生长来对双链的断裂产生反应，这意味着经历CRISPR细胞的生长和分裂效率会降低，而且携带p53基因突变的细胞会持续生长并分裂，从而使其更具优势。如果发生基因组错误，p53基因就会停止细胞分裂，并试图纠正细胞出现的问题；如果错误不能被修复的话，p53就会在细胞发生癌变之前开启程序性的细胞死亡，这就使得p53成为了一种关键的抗癌基因，失去其功能就会让人们对肿瘤更加易感。P53基因如此重要以至于其被称之为基因组的守护者。

研究者Eytan Ruppin指出，这篇文章中，我们分析了p53对近1000个人类细胞系中出现的双链断裂所产生的反应，在几乎所有的细胞类型中，我们都发现，当进行CRISPR-Cas9所介导的基因敲除后，携带正常p53基因的细胞就会表现出生长减缓，而携带突变p53基因的细胞则受到的影响较小，从而就能使其生长迅速且优于正常细胞；此外研究者还发现，CRISPR或能介导携带其它癌症相关突变的细胞表现出一定的优势，比如携带KRAS癌基因的细胞等。这并不是研究者第一次揭示出CRISPR基因编辑技术或会引入潜在的危险改变，然而本文研究却是研究人员首次在多种人类细胞中揭示出CRISPR技术所带来的潜在影响。

8.Immunity：利用CRISPR筛选鉴定出新的抗炎药物靶标
doi:10.1016/j.immuni.2021.10.011

-在一项新的研究中，来自美国范德堡大学的研究人员发现一种在癌症生物学中被研究过并对T细胞功能很重要的代谢酶可能为抗炎治疗提供一种新的靶标。他们报告说，抑制这种称为MTHFD2的代谢酶或者从基因上剔除这种代谢酶，可以减少多种炎症性疾病模型中的疾病严重性。相关研究结果于2021年11月11日在线发表在Immunity期刊上，论文标题为“MTHFD2 is a metabolic checkpoint controlling effector and regulatory T cell fate and function”。

图片来自Immunity, 2021, doi:10.1016/j.immuni.2021.10.011。

为了系统地研究T细胞---对特定抗原（如病毒的表面蛋白）作出反应的白细胞--中的途径，Rathmell实验室的医学博士生Ayaka Sugiura利用基因组编辑技术CRISPR开发出一种筛选策略。她设计了CRISPR“向导”---向导RNA（gRNA），以选择性地灭活一氧化碳代谢途径中的每个基因，并将这种筛选工具引入分离的T细胞，仔细控制实验条件，使每个T细胞只有一个（或没有）灭活的基因。

通过在一种哮喘的动物模型中研究这些经过基因修饰的T细胞，Sugiura能够确定在疾病过程中对T细胞功能重要的基因。然后，她研究了每个鉴定出的基因在T细胞发育过程中和各种炎症性疾病患者中的表达。MTHFD2脱颖而出。Sugiura说，它在疾病状态和胚胎发育过程中高度表达，但在成体组织中却低水平表达，或者根本不表达。

9.Nature子刊：利用新型碱基编辑器实现可控的基因组编辑
doi:10.1038/s41589-021-00880-w

在一项新的研究中，来自美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员开发出一种新型的基因编辑技术：通过分裂特定的突变酶然后触发它们重新组合在一起，在基因组中引入靶向突变。与其他现有技术相比，这种新型的基因编辑技术具有卓越的控制能力，并有可能在体内使用。相关研究结果于2021年10月18日在线发表在Nature Chemical Biology期刊上，论文标题为“Controllable genome editing with split-engineered base editors”。论文通讯作者为宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Rahul Kohli博士和Junwei Shi博士。

这些作者发现DNA脱氨酶可以被分割成两个无活性的部分，然后可以使用一种叫做雷帕霉素（rapamycin）的细胞渗透性小分子将它们重新组合起来。这种新的分裂-工程碱基编辑器（split-engineered base editor, eBE）可以被引入细胞中并在细胞内保持休眠，直到加入雷帕霉素，此时这种碱基编辑复合物可以迅速“开启”以改变基因组。

Kohli说，“我们新构建的eBE确实为研究和治疗提供了新的潜力。由于我们可以控制产生突变的时间，有可能在体内使用这种seBE通过改变一个基因来模拟疾病，类似于科学家控制基因敲除的时间，甚至有可能有一天为临床医生提供控制对患者的基因进行编辑的能力，以达到治疗的目的。”（生物谷 Bioon.com）