Nat Biotechnol：利用基于CRISPR的方法揭示人类巨细胞病毒的致命弱点

2021年11月22日讯/生物谷BIOON/---许多人---大约一半的成年人---都感染了一种叫做人类巨细胞病毒（HCMV的疱疹病毒。尽管大多数情况下没有症状，但该病毒对免疫力低下的人和未出生的婴儿来说是危险的。由于HCMV如此广泛存在，婴儿在子宫内被感染的几率大约是200分之一，而这种感染可能导致婴儿的大脑、肺部和生长出现问题。

在一项新的研究中，美国怀特黑德生物医学研究所成员Jonathan Weissman及其团队将前沿的CRISPR和单细胞测序技术用于这种病毒，迄今为止最详细地描述病毒和人类基因如何相互作用以形成HCMV感染，并揭示了通过操纵病毒和宿主基因有可能破坏这种病毒感染进展的新方法。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Functional single-cell genomics of human cytomegalovirus infection”。

这篇论文可能为未来的宿主-病原体相互作用的研究提供一个重要的路线图，并为抗病毒药物设计提供参考。在这个项目过程中，这些作者列出了一份病毒和宿主基因的清单，这些基因要么是HCMV复制所必需的，要么可能被操纵以赋予宿主细胞一些免疫力。论文第一作者、Weissman实验室前博士后研究员Marco Hein说，“如今我们就有了一个潜在的靶标清单，人们现在可以去开发靶向这些靶标的药物。”

看清双方

数百万年的进化在病毒和宿主之间形成了一个复杂的相互作用网络。例如，病毒有自己的一套基因，但它们也依赖于一些称为宿主因子的人类基因。劫持这些宿主因子使病毒能够入侵身体中的细胞并复制它们自己的遗传物质。

Hein试图更彻底地了解在整个感染过程中产生的宿主-病毒相互作用的网络。Hein说，“[我们想知道]当我们[敲除或削弱]这些关键因子时，实际上会发生什么。我们能防止感染吗？如果是这样，从病毒的角度看，什么地方'出错'了？”

他们选择HCMV作为测试对象是因为，首先，该病毒像人类一样有双链DNA基因组。这意味着通过剪断DNA来发挥作用的CRISPR技术理论上可以对病毒和宿主都有效。Weissman，“由于HCMV是一种重要的人类病原体，而且它是一种如此复杂和错综复杂的病毒，我们认为我们将有机会真正发现新的东西。”

一系列筛选

这些作者首先利用一种叫做CRISPR筛选的分子技术，确定病毒或宿主基因组的任何区域是否对被感染的宿主细胞的命运有特别的影响。通过系统地敲除大量病毒和宿主细胞中的单个基因，他们可以评估每个基因对HCMV感染的重要性。

2016年，随着可获得的大规模单细胞测序技术的发展，该项目有了一个新的维度。Hein说，“我们有这个想法，把CRISPR筛选和单细胞测序以及[一种叫做PerturbSeq的筛选方法]组合在一起。基本上，你扰乱一个细胞群体中的基因，然后你读出这些细胞发生了什么，不仅仅是通过测量存活率，而且还通过实际观察这些细胞中基因表达的模式。”

针对宿主的CRISPRi和CRISPRn筛选，图片来自Nature Biotechnology, 2021, doi:10.1038/s41587-021-01059-3。

结合这些方法产生了一组巨大的数据，这为这些作者提供了一个更清晰的观点，即哪些基因是重要的，在什么时候重要。Weissman说，“单细胞测序让我们以更高的精度观察病毒生命周期的各个步骤，然后这种扰动让我们了解宿主和病毒因子如何让病毒操纵宿主并完成其生命周期。”

由此产生的数据显示，HCMV的典型轨迹--从最初的病毒基因表达，到完整的病毒基因组的复制，再到最后一步通过出芽形成新的病毒颗粒---如何可能通过改变特定的病毒基因而使之偏离正常轨迹。这还让这些作者了解到这种病毒在哪些阶段依赖哪些宿主基因来实现“成功”感染。

Hein说，“这种感染的过程是预先重编程到病毒基因组的。如果你想干扰这种感染的过程，你可以通过靶向病毒因子来做到这一点，或者你可以通过靶向宿主因子来间接做到这一点。结果在概念上是不同的。如果你靶向病毒因子，你就会破坏这种病毒通常会遵循的感染程序。如果你靶向宿主因子，这种感染程序本身是不变的，但你改变了这种病毒执行这种感染程序的程度。”

这些发现将成为开发可作为抗病毒“鸡尾酒”一部分的药物的有用工具。由于病毒和其他病原体发生突变和适应不断变化的条件，抗病毒治疗的一个共同点是将几种靶向不同病毒靶标的药物结合起来。这确保了尽可能彻底地根除病毒，减少了一些病毒存活并产生新的抗药性群体的几率。

虽然这些作者提供的必需病毒基因清单揭示了HCMV中可用药物鸡尾酒靶向的区域，但是为病毒成功感染作出贡献的人类基因清单可能为更间接的疗法打开大门。Hein说，“如果你靶向宿主因子来影响病毒，那么病毒要逃脱就会困难得多，它必须发生突变以摆脱对宿主蛋白的依赖，这就复杂得多。”

当然，潜在地靶向人类基因或蛋白来治疗感染也有缺点，要想通过这种研究途径获得可行的治疗方法，还需要做更多的研究工作。Hein说，“如果你靶向宿主因子，顾名思义，你靶向我们体内的一种正常工作的蛋白，所以副作用的风险要高得多。”

在未来，Hein和Weissman希望将他们研究感染的多层次方法用于研究其他病毒，如SARS-CoV-2。虽然这种新型冠状病毒没有可以通过CRISPR改变的双链DNA，但是他们仍然可以调查哪些宿主基因在感染的哪个阶段是必不可少的，并使用这种方法驱动的方法，希望能从一种研究良好的病毒中收集到意想不到的发现。

Hein说，“我总是被技术能做的事情所驱动。我喜欢以全系统的方式进行研究，然后得出一些发现，如果你一次只研究一个基因或蛋白，或更多地以传统方式观察事物，你就不会得出这样的发现。这种高层次的结论是我个人认为最令人兴奋的。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Marco Y. Hein et al. Functional single-cell genomics of human cytomegalovirus infection. Nature Biotechnology, 2021, doi:10.1038/s41587-021-01059-3.