开发一种新型 PTD 介导的 IVT-mRNA 递送平台，用于代谢/遗传疾病的潜在蛋白质替代疗法

强大的体外转录 (IVT)-mRNA 的潜在临床应用，以恢复有缺陷的蛋白质功能，很大程度上取决于它们通过开发安全有效的传递平台成功的细胞内传递和瞬时翻译。本研究开发了一种创新的(国际专利申请中)方法，将ivt - mrna与蛋白转导域(PTD)技术相结合，作为一种高效的递送平台。

基于 PTD 技术，该技术能够将各种货物在细胞内进行细胞内递送，实现了 PTD 与 IVT-mRNA 的成功结合，并通过带移分析和核磁共振光谱进行了评估。此外，将ptd - ivtmrna应用于两种蛋白疾病模型并进行评估，包括线粒体疾病致死性婴儿心脑肌病和细胞色素c氧化酶(COX)缺乏(归因于SCO2基因突变)和b-地中海贫血。SCO2的PTD-IVT-mRNA在一个SCO2/ cox缺陷患者的原代成纤维细胞内成功转导并翻译成相应的SCO2蛋白，而b-珠蛋白PTD-IVT-mRNA在来自3个b-地中海贫血患者的骨髓细胞中被转导并翻译。

图片来源：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.09.008.

尽管体外转录(IVT)-mRNA是在细胞外产生的，但它保留了介导遗传信息转化为受体细胞蛋白质的能力。IVTmRNA技术的主要优点是，mRNA分子的转导不会引起致癌突变，这与通过逆转录病毒/慢病毒载体应用的基因治疗策略不同。原则上，基于ivt - mrna的治疗方法适用于广泛的急慢性疾病，包括可通过蛋白质替代疗法(PRT)、基因组编辑、细胞命运重编程和癌症免疫治疗治愈的疾病。

值得一提的是，基于ivt - mrna的疫苗已经成为人们关注的焦点，因为全球迫切需要为SARS-CoV-2冠状病毒引起的COVID-19大流行接种疫苗。在已开发的各种方法中，BioNTech/辉瑞和Moderna IVT-mRNA疫苗是第一批注射到人类志愿者体内的疫苗，并获得初步批准用于紧急用途。与耗时更久的传统疫苗相比，它们提供了显著的优势，例如更快、更容易制造和临床开发。

IVT-mRNA可以通过受体介导的机制转导到真核细胞，尽管在大多数细胞类型中摄取率极低。此外，IVT-mRNA易受酶降解的问题，影响其在高RNase活性液体中的结构和功能稳定性，是非常令人关注的问题。然而，已经发现通过化学和结构修饰适当的IVT-mRNA的结构设计可以潜在地通过提高mRNA的翻译效率来控制其半衰期和翻译速率。

这些修改包括但不限于以下内容:(1)添加抗逆转帽类似物(ARCAs); (2)修饰的核苷，如5mC(5-甲基胞苷)和J (伪尿苷); (3) IVT-mRNA 3’端聚腺苷酸化; (4)取代腺苷酸/尿苷酸富元素(富au元素，AREs;如小鼠的b-球蛋白基因的5’ UTR，以及人类的a-球蛋白或b-球蛋白基因的3’ UTR; (5)在5’ UTR处存在一个强烈的Kozak序列来启动翻译。

IVT-mRNA的细胞内传递可以通过多种方法介导，包括细胞膜破坏(通过电穿孔或基因枪)，导致相当高比例的死亡细胞，尽管目前正在努力提高安全性和有效性。此外，IVT-mRNA 递送可以通过各种纳米颗粒 (NP) 介导的递送系统进行介导。后者包括具有阳离子表面电荷的脂基和聚合物基体系，这是与带负电荷的mRNA分子络合的主要特征。然而，由于表面电荷、胶体不稳定性、血清稳定性差以及快速清除都发挥着重要作用，因此仍需要替代IVT-mRNA传递系统。

SCO2 PTD-IVT-mRNA转导SCO2缺乏的原代成纤维细胞COX活性的组织化学检测

图片来源：https://doi.org/10.1016/j.omtn.2021.09.008

在本研究中，作者试图设计一种新的ivt - mrna和蛋白质转导结构域(PTDs)之间的偶联反应，以实现一种替代的、有效的、可能更安全的方法，将ivt - mrna传递到培养的人类细胞系中。PTD技术使用的短肽能够穿透几乎所有的细胞膜，并在细胞内携带各种货物，从小分子和小干扰rna (sirna)到大分子(蛋白质、rna、质粒DNA、NPs)，具有相对较高的转导效率和较低的细胞毒性。

本研究的主要目标是设计一种方法来构建和开发一种新的PTD-IVT-mRNA平台，利用已建立的PTD，将IVT-mRNA分别有效地传递到Sco2和b-珠蛋白缺失的人成纤维细胞和造血细胞中。该平台解决了ivt - mrna的稳定性、转导和转译问题，并允许通过其相应转导的ivt - mrna的有效转译来实现感兴趣的蛋白质的瞬时生产。总之，该平台为高效PRT提供了合适的途径，适用于各种单基因/代谢疾病。（生物谷 Bioon.com）

参考文献

Androulla N. Miliotou et al. Development of a novel PTD-mediated IVT-mRNA delivery platform for potential protein replacement therapy of metabolic/genetic disorders. Mol Ther Nucleic Acids 2021 Sep 20;26:694-710. doi: 10.1016/j.omtn.2021.09.008.