Science子刊：利用两种基因编辑策略**校正DMD外显子缺失突变，可恢复97%的dystrophin蛋白产生

2021年5月26日讯/生物谷BIOON/---杜兴氏肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy, DMD，也译为杜兴氏肌肉营养不良症）是儿童中的一种最常见的致命性遗传疾病。DMD在男孩中的发病率为1/5000。它导致肌肉和心脏衰竭，并导致在30岁出头时过早死亡。当患者的肌肉退化时，他们被迫坐在轮椅上，而且当他们的横膈膜减弱时，他们最终依赖呼吸器进行呼吸。尽管科学家们几十年来已知抗肌萎缩蛋白（dystrophin）编码基因发生让这种蛋白不能表达的突变导致这种疾病，但是迄今为止还没有一种有效的治疗方法存在着。 虽然科学家们已鉴定出导致DMD的数千种不同突变，但是这些突变往往集中在dystrophin基因的某些部分上。其中的一些突变导致肌肉细胞产生短小、功能较差的dystrophin蛋白版本。

在一项新的研究中，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的研究人员成功地采用了一种新型的基因疗法来治疗DMD小鼠，独特地利用基于CRISPR-Cas9的工具来恢复在许多DMD患者中缺失的一大部分dystrophin蛋白。这种方法可能会开发用于治疗DMD的方法，并为其他遗传性疾病的治疗提供参考。相关研究结果近期发表在Science Advances期刊上，论文标题为“Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing”。

这些作者利用了这样一个事实，即dystrophin基因是由许多不同的称为外显子的片段组成的，其中的一些外显子是可有可无的。在大约8%的DMD男孩中，由于51号外显子中发生导致身体停止产生这种蛋白的缺失突变（∆Ex51），近一半的dystrophin蛋白缺失了。他们开发出多种成功的CRISPR-Cas9核苷酸基因编辑策略，以跳过这种错误的“停止”信号，恢复了97%的dystrophin蛋白产生。一些策略通过移除相邻的外显子而发挥作用，而其他策略则利用微小的基因增减来使这种蛋白的产生回到正轨。这意味着他们的方法的力量在于不需要为每个携带新突变的DMD患者采取新的基因编辑策略，相反可以采用一种综合的方法校正多种不同的突变。

当这些作者在携带dystrophin突变的小鼠身上使用这种新方法时，在三周内，dystrophin蛋白的功能性版本在所有腿部肌肉纤维的一半以上中恢复了。此外，他们发现，他们可以使用从患有DMD的小鼠或人类体内分离出的细胞，在治疗前测试该方法是否会在某个特定患者中取得成功。分离的细胞在体外经诱导后产生诱导性多能干细胞（iPS细胞），随后让ips细胞分化为心肌细胞。

这项新的研究中多种基因编辑使用策略，图片来自Science Advances, 2021, doi:10.1126/sciadv.abg4910。

具体而言，他们将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）的一个优化版本（即ABEmax）包装到腺相关病毒9（AAV9）载体中，并作为split-intein反式剪接系统，通过肌肉内注射将携带ABEmax的AAV9递送到∆Ex51 DMD小鼠模型中，可恢复dystrophin蛋白表达。然后，他们验证了ABEmax通过靶向剪接供体位点（SDS）在DMD基因座上进行外显子跳读的功效，以及在人类ΔEx51 DMD ips细胞中进行外显子重构（exon reframing）的引导编辑（prime editing，即融合的逆转录酶通过扩展的向导RNA模板引入编辑）的功效。

在培养皿中，他们可以观察这两种基因编辑方法是否有助于心肌细胞更好地发挥作用。他们指出利用来自DMD患者的ips细胞分化而来的心肌细胞，他们快速测试了他们的核苷酸基因编辑方法，并证实dystrophin蛋白成功恢复了。

这项新研究中报告的基因疗法还没有准备好用于患有DMD的人类。首先还需要在动物身上进行更多的安全研究，同时还需要开展更多的研究工作来优化将基因编辑工具递送到肌肉细胞和心肌细胞中的病毒载体。但是，通过显示多种CRISPR-Cas9策略可以校正突变，这些作者已经扩大了针对DMD的潜在基因治疗方案的工具箱。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

F. Chemello et al. Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing. Science Advances, 2021, doi:10.1126/sciadv.abg4910.