Nature：重大进展！我国科学家开发出非病毒的基因特异性靶向CAR-T细胞，并在临床试验中证实它们可安全有效地治疗复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤

近年来，嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）疗法迅速发展，它在癌症治疗中显示出巨大的潜力。然而，一些局限性仍然存在，包括目前的CAR-T细胞疗法的复杂制造过程、高生产成本、较长的制备时间和潜在的安全问题。在CAR-T细胞生产中使用病毒是一个令人担忧的领域，因为这种方法的缺点包括插入突变导致的肿瘤产生风险增加。此外，对病毒DNA的特异性反应往往会阻碍CAR的表达，而且病毒制备本身经常会产生高额费用。尽管一些不使用病毒的策略，如使用转座子系统和mRNA转导，正在用来产生CAR-T细胞，但随机整合和CAR表达中断导致的CAR-T细胞同质性较低成为额外的问题。近期，一些研究表明，通过使用腺相关病毒（AAV）载体作为模板，可以应用基因组编辑技术来产生基因座特异性整合的CAR-T细胞。此外，有人提出了一种优选的非病毒策略，以产生可校正点突变和精确插入T细胞受体（TCR）的T细胞产品。

为了同时解决病毒使用和随机整合的缺点，来自中国浙江大学和华东师范大学等研究机构的研究人员利用CRISPR-Cas9开发出非病毒的、基因特异性靶向CAR-T细胞，并一项1期开放标签的单臂临床试验中证实它们在治疗8名复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（relapsed/refractory B cell non-Hodgkin lymphoma,  r/r B-NHL）患者中的高安全性和有效性。相关研究结果近期发表在Nature期刊上，论文标题为“Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL”。

据这些作者的说法，他们是世界上首次在临床试验中证实非病毒的、基因特异性靶向CAR-T细胞的安全性和有效性的。通过使用非病毒的、将靶向CD19的CAR整合到PD1基因中的CAR-T细胞（PD1-19bbz CAR-T细胞），他们发现接受这些CAR-T细胞治疗的r/r B-NHL患者具有显著的安全性，只有较低的轻度细胞因子释放综合征（CRS）发生率，并且没有发生神经系统毒性。他们的临床前实验也表明不论肿瘤细胞是否较高地表达PD-L1，PD1-19bbz CAR-T细胞都能高效地清除它们。这些研究结果也与之前报道的两项临床试验一致，因而进一步证实了CRISPR-Cas9应用于T细胞治疗的安全性。与此同时，他们观察到较高的完全缓解率和持久的完全缓解。特别是在两名PD-L1高表达的r/r B-NHL患者中发现了反应（尽管后来一名患者发生了CD19-肿瘤复发）。令人惊讶的是，尽管初始的PD1-19bbz CAR-T细胞剂量（没公斤体重输注2×10⁶个细胞）出乎意料地低，或者由于早期和仍然不成熟的制造过程导致CAR+细胞的比例很低，但是在12个月的中位观察期间，8名患者中有7人实现了完全缓解，这表明这些PD1-19bbz CAR-T细胞具有更强的杀死肿瘤细胞的效力。

非病毒的将CAR整合到AAVS1基因中的CAR-T细胞有效消除肿瘤细胞。图片来自Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05140-y。

这些作者的临床前和临床数据表明，PD1-19bbz CAR-T细胞对肿瘤细胞有较高的杀伤效果，这可以用两个特点来解释。首先，单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据显示，在PD1-19bbz CAR-T细胞中存在高比例的记忆T细胞。第二，基因集合富集分析结果表明，将靶向CD19的CAR整合到PD1基因中实现的PD1破坏使得PD1-19bbz CAR-T细胞具有增强的抗肿瘤功能。在小鼠模型中发现，与将靶向CD19的CAR整合到AAVS1基因中的CAR-T细胞相比，PD1-19bbz CAR-T细胞更有力地消除了肿瘤细胞，从而验证了这种优势。值得注意的是，这种优势甚至在PD-L1低表达的肿瘤细胞中也被观察到。此外，鉴于除PD1之外的其他抑制性受体（比如LAG3、TIM3和TIGIT）在临床输注后仍在PD1-19bbz CAR-T细胞中高度表达，同时对多种抑制途径进行干预有望进一步增强CAR-T细胞的功能。

综上所述，这些作者描述了一种通过CRISPR-Cas9开发非病毒的基因特异性靶向CAR-T细胞的新策略。这项技术之所以先进，是因为结合了非病毒制造工艺和精确基因组编辑的优势。作为一种不使用病毒的二合一方法，CAR-T细胞的制造程序得到简化，缩短了制备时间，减少了生产费用，提高了CAR-T细胞产品的安全性和有效性。这些优势非常重要，特别是对于制造经过基因修饰的CAR-T细胞来说，通常需要同时进行病毒制备和基因组编辑过程。此外，基因座特异性整合增强了CAR-T细胞的同质性，使得它们有可能利用多功能的细胞产品。重要的是，他们展示了这种技术从实验室到临床的可行应用，并在临床试验中证实了它的高度安全性和有效性。因此，他们提出了一种创新的突破目前的障碍的CAR-T细胞技术，并展示了CRISPR-Cas9介导的非病毒、基因特异性靶向技术在细胞治疗中的巨大潜力。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Jiqin Zhang et al. Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL. Nature, 2022, doi:10.1038/s41586-022-05140-y.