2019年4月CRISPR/Cas研究进展

2019年4月30日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。

即将过去的4月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。

1.Nature：开发出Cas9-MMEJ可编程基因编辑方法，有望治疗143种由DNA微重复引起的疾病
doi:10.1038/s41586-019-1076-8

在一项新的研究中，来自美国马萨诸塞大学医学院的研究人员开发出一种利用CRISPR-Cas9和一种很少使用的DNA修复途径编辑和修复一种特定类型的与微重复（microduplication）相关的基因突变。这种可编程基因编辑方法克服了之前在基因校正中所遭遇的低效率。相 关研究结果于2019年4月3日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break”。

微重复是染色体发生变化而使得 DNA上的小片段被拷贝或复制。在某些基因中，当添加的核苷酸数量不能被3整除时，这些微重复就能够导致所谓的“移码突变”。这改变了基因向蛋白的翻译，从而导致功能丧失。由微重复引起的移码突变导致多达143种不同的疾病，包 括肢带肌营养不良（limb-girdle muscular dystrophy）、赫曼斯基-普德拉克综合征（Hermansky-Pudlak syndrome）和家族黑蒙性白痴病（Tay-Sachs）。

论文共同通讯作者、马萨诸塞大学医学院分子、细胞与癌症生物学教授Scot A. Wolfe博士和论文共同通讯作者、马萨诸塞大学医学院威尔斯通肌肉营养不良中心主任、神经学教授Charles P Emerson Jr.博士认为可能存在更为直接的方法来校正由微重复引起的疾病。他 们推断如果微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）途径可以被有效利用，而不是利用同源介导修复途径，它将会移除重复序列并恢复基因的功能序列。

Emerson博士有一个很有希望的疾病目标，用于评估这种编辑方法的可行性---由TCAP基因中的微重复引起的2G型肢带肌营养不良（LGMD2G）。Emerson实验室和Wolfe实验室构建的酿脓链球菌Cas9核酸酶（Strestococcus pyogenes Cas9, SpCas9）靶向TCAP基因的微重复中 心附近的DNA断裂。他们接着利用SpCas9处理了源自LGMD2G患者的多能性干细胞。正如他们预测的那样，MMEJ修复机制移除了这种微重复的一个拷贝---有效地将DNA重新拼接在一起，拼接效率非常高，因而去除了突变的遗传物质并让这个基因得到恢复，从而能够产生正常 的TCAP蛋白。

2.Science子刊：我国科学家开发出一种可远程控制的基因编辑平台
doi:10.1126/sciadv.aav7199

在一项新的研究中，来自中国南京大学、南京工业大学和厦门大学的研究人员开发出利用病毒将CRISPR-Cas9基因编辑工具运送到特定细胞中的一种替代载体，它涉及使用两种类型的光。相关研究结果发表在2019年4月3日的Science Advances期刊上，论文标题为“Near- infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform”。在这篇论文中，他们描述了他们的新型载体以及它在试验用小鼠中的效果。论文通讯作者为南京大学的宋玉君（Yujun Song）教授、南京工业大学的王玉珍 （Yuzhen Wang）副研究员和厦门大学的林友辉（Youhui Lin）副教授。

这种载体系统由对低能近红外辐射（NIR）敏感并发出紫外光的上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticle, UCNP）组成。当近红外光照射在这些上转换纳米颗粒上时，这种光被吸收并转换成紫外光，所产生的紫外光会发射出去。在细胞内部，这种载体系统可通过给 皮肤照射近红外光加以激活。照射的近红外光穿过皮肤进入体内，并前去寻找这种载体系统。当近红外光被上转换纳米颗粒转化为紫外光时，它切割这种载体系统中的分子，从而释放出这种基因编辑工具来完成它的作用。

在实际的实验中，这些研究人员通过注射将CRISPR-Cas9工具直接递送至小鼠内部的癌性肿瘤中。当它安全就位时，他们将近红外光照射到位于肿瘤（和基因编辑工具）所在部位上方的皮肤上。当所产生的紫外光释放出这种基因编辑工具时，它开始编辑一种允许肿瘤生长 的蛋白，最终结果就是肿瘤尺寸减小。

3.Science子刊重大突破！首次利用CRISPR技术实现子宫内胎儿遗传疾病治疗
doi:10.1126/scitranslmed.aav8375

费城儿童医院(CHOP)和宾夕法尼亚医学院的一个研究小组利用CRISPR基因编辑技术，在一种动物模型中成功地阻止了一种致命的肺部疾病。这种动物模型中，一种有害的突变会导致幼体出生后几小时内死亡，相关研究成果于近日发表在《Science Translational Medicine》上，这项概念验证性研究表明，子宫内编辑可能是一种在出生前治疗肺部疾病的很有前途的治疗新方法。

研究人员发现，在胎儿发育过程中，准确地向羊水中注入CRISPR基因编辑器可导致小鼠肺部发生有针对性的变化。他们在老鼠出生前4天将基因编辑器引入老鼠体内，这与人类的妊娠晚期相似。研究结果发现编辑率最高的细胞为肺泡上皮细胞和排列在肺气道内的气道分泌 细胞。

在第二个实验中，研究人员使用产前基因编辑技术，在小鼠模型中降低了肺间质疾病——表面活性蛋白C (SFTPC)缺陷的严重程度。未经治疗的携带这种突变的小鼠在出生后数小时内全部死于呼吸衰竭。相比之下，产前基因编辑使突变的Sftpc基因失活，可以使超过22%的 动物的肺形态和存活率得到改善。未来的研究将致力于提高肺上皮组织基因编辑的效率，以及评估将基因编辑技术传递给肺的不同机制。

4.Nature：震惊！CRISPR碱基编辑器能够诱导大量的脱靶RNA编辑
doi:10.1038/s41586-019-1161-z

在一项新的研究中，来自美国麻省总医院、哈佛医学院和哈佛大学陈曾熙公共卫生学院的研究人员报道近期开发的几种在单个DNA碱基中产生靶向变化的碱基编辑器能够在RNA中诱导广泛的脱靶效应。他们还描述了对碱基编辑器变体进行基因改造可显著降低RNA编辑的发生 率，这同时也会增加在靶DNA编辑的精确度。相关研究结果于2019年4月17日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors”。

论文通讯作者、麻省总医院病理学系的J. Keith Joung博士说道，“大多数关于脱靶基因编辑的研究都集中在DNA上，但是我们发现这种技术也可以诱导大量的RNA改变。这一令人吃惊的发现表明，当考虑碱基编辑器在细胞中的不想要的脱靶效应时，需要考虑的不仅仅是 基因变化。我们还发现构建选择性地降低脱靶RNA编辑同时保留想要的在靶DNA编辑的变体来减少这些影响是可行的。”

为了研究减少或消除不需要的RNA编辑的可能性，Joung团队筛选了16种具有脱氨酶改造版本的碱基编辑器（即碱基编辑器改造版本），从中鉴定出两种碱基编辑器改造版本与它们的原始版本同样高效地诱导在靶DNA编辑，同时诱导显著少的RNA编辑。实际上，这些SECURE （SElective Curbing of Unwanted RNA Editing, 选择性抑制不需要的RNA编辑）变体甚至要比未经基因改造的脱氨酶更精确地诱导所需的DNA编辑。

5.Nat Biotechnol：让gRNA形成发夹结构可提高CRISPR系统的准确性，提高50倍
doi:10.1038/s41587-019-0095-1

在一项新的研究中，来自美国杜克大学的研究人员开发出一种方法，可将CRISPR基因组编辑技术的准确性平均提高50倍。他们认为它可以很容易地扩展到这种基因编辑技术的不断扩大的其他形式。这种方法给用于识别待编辑的DNA序列的向导RNA（gRNA）添加一条短尾巴 。这条增加的尾巴折叠回来进行自我结合，从而产生一把仅由靶DNA序列打开的“锁”。相关研究结果于2019年4月15日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures”。

接下来，这些研究人员希望看到这种方法可以处理多少种不同的CRISPR变体，并对这种上锁机制的工作原理进行深入的描述，以便观察不同CRISPR变体之间是否存在差异。鉴于这些实验是在体外培养的细胞中进行的，他们迫切希望看到这种方法在实际的动物疾病模型中 如何可能提高CRISPR的准确性。

6.JEM：利用CRISPR/Cas9对B细胞进行基因编辑有望开发出HIV疫苗
doi:10.1084/jem.20190287

人体不能自然地保护自己免受HIV病毒感染---至少通常不能做到这一点。但是，在极少数情况下，受感染的个体会产生对抗这种病毒的广泛中和抗体（bNAb）。如今，在一项新的研究中，来自美国洛克菲勒大学的研究人员设计出一种方法，将这种对抗HIV的能力赋予给普 通的免疫细胞。相关研究结果于2019年4月11日在线发表在Journal of Experimental Medicine期刊上，论文标题为“HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells”。论文通讯作者为洛克菲勒大学的Michel C. Nussenzweig博士。 Nussenzweig和他的同事们使用CRISPR-Cas9基因编辑技术来修饰B细胞，即一种分泌抗体的白细胞。具体而言，他们对小鼠B细胞进行基因改造，使得它们自己产生人bNAb。他们发现，以这种方式发生改变的B细胞产生的抗体水平足以保护小鼠免受HIV感染，这表明这种技 术最终可能用作一种免疫工具。

虽然这项研究仍处于早期阶段，但是它证实了通过基因编辑增强免疫应答的可行性。重要的是，这种技术不会影响生殖细胞，因而避免了有时由CRISPR干预引起的伦理问题。如果能够实现，这种新的免疫方法不仅可以用于治疗HIV感染，而且还可以用于治疗任何对特定抗 体敏感的疾病。

7.Science：开发出一种检测CRISPR脱靶效应的新方法---DISCOVER-Seq
doi:10.1126/science.aav9023; doi:10.1126/science.aax1827

自从CRISPR基因组编辑技术于2012年发明以来，它已经显示出治疗许多难治性疾病的巨大希望。然而，科学家们一直在努力在治疗相关的细胞类型中鉴定潜在的脱靶效应，这仍然是将治疗方法转移到临床应用的主要障碍。如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学伯 克利分校、加州大学旧金山分校、格拉德斯通研究所和瑞典阿斯利康公司的研究人员开发出一种可靠的方法来实现这一目标。相关研究结果发表在2019年4月19日的Science期刊上，论文标题为“Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq ”。论文通讯作者为加州大学伯克利分校的Jacob E. Corn。论文第一作者为加州大学伯克利分校的Beeke Wienert和Stacia Wyman。

CRISPR通过在特定位置切割DNA来编辑人的基因组。所面临的挑战是确保这种工具不会在其他地方进行切割，即一种被称为“脱靶效应”的DNA损伤，这可能会带来无法预料的后果。Wienert博士说，“当CRISPR进行切割时，DNA会被破坏。因此，为了生存，细胞将许多不 同的DNA修复因子募集到基因组中的特定位点上以修复断裂并将切割末端连接在一起。我们认为如果我们能够找到这些DNA修复因子的位置，我们就可以鉴定出被CRISPR切割的位点。”

为了测试这种想法，这些研究人员研究了一组不同的DNA修复因子。他们发现其中的一种称为MRE11的DNA修复因子是DNA切割位点的第一批响应者之一。他们利用MRE11开发了一种名为DISCOVER-Seq的新技术，它可以识别出CRISPR切割基因组的确切位点。

Corn说，“鉴于我们的方法依赖于细胞的自然修复过程来识别切割位点，它经证实是一种侵入性更小、更可靠的方法。我们能够在诱导性多能干细胞、患者细胞和小鼠中测试我们新开发的DISCOVER-Seq方法，而且我们的研究结果表明这种方法可潜在地用于任何系统，而 不仅仅是在实验室中。”

8.PNAS：在人细胞中构建出一种强大的基于CRISPR/Cas9的双核CPU
doi:10.1073/pnas.1821740116

在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员将两个基于CRISPR-Cas9的核心处理器整合到人体细胞中，这代表了在构建强大的生物计算机方面迈出了重要的一步。相关研究结果发表在2019年4月9日的PNAS期刊上，论文标题为“A CRISPR/Cas9-based central processing unit to program complex logic computation in human cells”。论文通讯作者为苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系生物技术与生物工程教授Martin Fussenegger。

Fussenegger及其团队利用生物组分构建一种灵活的称为中央处理单元（CPU）的核心处理器，它接受不同类型的编程。他们开发出的这种处理器基于经过基因修饰的CRISPR-Cas9系统，并且基本上能够以RNA分子（称为向导RNA）的形式接受所需数量的输入。

Cas9蛋白的一种特殊变体构成了这种处理器的核心。通过对由向导RNA（gRNA）序列递送的输入作出反应，CPU调节特定基因的表达，这个基因接着产生特定的蛋白。通过这种方法，这些研究人员能够对人体细胞中的可扩展电路进行编程---就像数字半加法器那样，它们由 两个输入和两个输出组成，并且能够执行两个单位二进制数的加法运算。

9.Nature子刊：开发出可在几分钟内检测基因突变的CRISPR芯片
doi:10.1038/s41551-019-0371-x

在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校和克莱蒙特学院联盟凯克研究所的研究人员将CRISPR与用石墨烯制成的电子晶体管结合在一起，构建出一种可在几分钟内检测出特定基因突变的新型手持设备。这种称为CRISPR-Chip（CRISPR芯片）的设备可用于快速诊断 遗传疾病或评估基因编辑技术的准确性。他们使用这种设备来鉴定来自杜兴氏肌营养不良（DMD）患者的DNA样品中的基因突变。相关研究结果于2019年3月25日在线发表在Nature Biomedical Engineering期刊上，论文标题为“Detection of unamplified target genes via CRISPR–Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor”。

论文通讯作者、克莱蒙特学院联盟凯克研究所助理教授Kiana Aran说道，“我们开发出首个利用CRISPR在基因组中搜索潜在突变的晶体管。仅需将纯化的DNA样品放在这种芯片上，让CRISPR进行这种搜索，这种石墨烯晶体管可在几分钟内报告搜索结果。”

但是与大多数形式的基因检测---包括近期开发的基于CRISPR的诊断技术---不同的是， CRISPR-Chip使用纳米电子技术来检测DNA样本中的基因突变，而无需首先通过一种称为聚合酶链式反应（PCR）的时间和设备密集型过程来对感兴趣的DNA片段进行数百万次“扩增”或 着说复制。这意味着它可能用于在医生办公室或野外工作环境中进行基因检测，而无需将样品送到实验室。

10.Blood：利用CRISPR-Cas12a基因编辑有望治疗β-地中海贫血
doi:10.1182/blood-2019-01-895094

根据世界卫生组织（WHO）的统计，镰状细胞病和β-地中海贫血每年在世界范围内共影响33.2万人怀孕或分娩。这两种疾病都涉及β珠蛋白编码基因发生突变。在β-地中海贫血中，突变阻止红细胞产生足够多的携氧血红蛋白分子，从而导致贫血。在镰状细胞病中，突变 导致血红蛋白改变形状，使得红细胞变形为僵硬的“镰刀”形状，从而阻塞血管。

在一项新的研究中，来自美国达纳法伯癌症研究所、波士顿儿童医院和马萨诸塞大学医学院等研究机构的研究人员通过将CRISPR-Cas12a基因编辑应用于患者自己的造血干细胞中，开发出一种治疗一种最为常见的遗传性血液疾病---β-地中海贫血---的策略。这种方法克 服了之前的技术挑战，而且要比过去更有效地对造血干细胞进行编辑。相关研究结果近期发表在Blood期刊上，论文标题为“Editing aberrant splice sites efficiently restores β-globin expression in β-thalassemia”。论文第一作者为Shuqian Xu。论文通讯 作者为Daniel Bauer博士和Scot Wolfe博士。

这新的研究发现这些经过基因编辑的造血干细胞产生得到基因校正的红细胞，因而能够产生功能性的血红蛋白。

在这项新的研究中，这些研究人员使用一种类似于CRISPR-Cas9的基因编辑方案来靶向涉及剪接突变---在β-珠蛋白编码基因附近的DNA片段出现差错改变读取这个基因以组装β-珠蛋白的方式---的β-地中海贫血形式。9名β地中海贫血患者捐献了他们的造血干细胞，这 样就可在培养皿中操纵它们。对于其中的一些患者，这些研究人员利用另一种不同的酶--- Cas12a---来更高效地靶向这些突变。CRISPR/Cas12a高效地进行基因编辑并恢复了来自每名患者的血细胞中β-珠蛋白编码基因的正常剪接。（生物谷 Bioon.com）