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Nat Methods:开发出CRISPR辅助的新技术来检测活细胞中的RNA结合蛋白 未来有望助力人类疾病研究

来源:本站原创 2020-07-26 22:57

2020年7月27日 讯 /生物谷BIOON/ --尽管目前科学家们还并未完全理解RNA分子的多样性,但他们认为,与这些RNA分子结合的RNA结合蛋白或与多种机体疾病的发生直接相关,近日,一项刊登在国际杂志Nature Methods上题为“CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells”的研究报告中,来自香港城市大学等机构的科学家们开发了一种名为CARPID的新型检测方法,其能识别活细胞中特殊RNAs的结合蛋白,这种新方法或能应用到多重类型的细胞研究领域,比如从识别癌症生物标志物到检测治疗多种病毒性疾病的潜在药物靶点等。

分子生物学的中心法则是DNA转录成为RNA,以及RNA最终翻译成为蛋白质,但实际上,只有大约2%的RNAs能够编码蛋白,而其余98%被称之为非编码RNAs(ncRNA)的RNA分子则由于其具有神秘的功能而被视为“暗物质”。近些年来,科学家们开始努力研究旨在揭开RNA的真实功能,尤其是长链非编码RNAs(lncRNA,长度仅有200多个核苷酸),lncRNA广泛被接受为能参与调节基因表达的重要细胞组分,同时其也是研究人员最感兴趣研究的RNA的一种。

图片来源:Nature Methods (2020) doi:10.1038/s41592-020-0866-0

尽管lncRNA并不能产生蛋白质,但其能与蛋白质之间相互作用,而其之间的相互作用能够决定lncRNA的功能,因此,识别出结合蛋白对于理解lncRNA的功能至关重要,然而当前的很多方法都存在一定的局限性,比如其会产生一些错误的阳性信号,而且无法对活体细胞进行操作等。

为了克服当前方法存在的局限性,研究人员就开发了一种新方法,其能将用于RNA靶向作用的先进基因编辑技术-CRISPR/dCasRx系统与近距离生物素标记技术相结合来识别活体细胞中蛋白质-蛋白质之间的相互作用;研究者将这种方法命名为CARPID(CRISPR 辅助的RNA-蛋白相互作用检测技术,CRISPR-Assisted RNA-Protein Interaction Detection),其能灵敏地检测任何长度或浓度的RNAs的结合蛋白,而其它大多数方法则仅能用于对长链非编码RNAs进行检测。

这种名为CARPID的新方法由两部分组成,即导航和邻近生物素标记,首先研究人员利用CRISPR/CasRx系统来进行导航以便包括名为BASU的标记工具在内的CARPID组分能够靠近靶点RNA,BASU是一种工程化的生物素连接酶,而这类连接酶能够将生物素(一种具有很强结合力的维生素)与结合了靶向RNA的蛋白质进行结合,这些蛋白质就会以这种方法来接近被标记的靶向RNA分子。当被标记后,研究人员就会利用名为链霉亲和素的生物素结合蛋白来识别被BASU所标记的蛋白质,随后研究者就能够很清楚地观察到这些结合蛋白了。

为了检测CARPID技术的特异性,研究人员对三种不同的lncRNAs(DANCR、XIST和MALAT1)进行了测试,实验结果表明,结合蛋白并没有太多重叠,这就说明,CARPID对于不同长度和表达水平的lncRNAs具有较高的特异性和适用性。研究者Yan说道,CARPID技术能实现较高的特异性,因为CRISPR的导航非常精准,我们甚至可以获取非常确切的信息,即蛋白质所结合的RNA的具体部位。此外,CARPID并不会影响靶向细胞的生理学状况,而且细胞也会以正常的基因表达水平而继续存活,在这种新技术的帮助下,如果研究者在不同的时间点检查到了相同的RNA靶点,那么他们就能获得动态的结果。此外,在蛋白质组技术的帮助下,研究人员还能够发现并证实此前在哺乳动物细胞中未被阐明特征的两种lncRNAs的结合蛋白的特性。

研究者认为,CARPID具有广泛的应用价值,包括能检测病毒RNA的结合蛋白,比如,SARS-CoV-2是一种会引发COVID-19的RNA病毒,一旦病毒进入宿主细胞后,研究者就能应用CARPID技术来检测病毒用来进行生命周期所招募的特殊细胞蛋白,如果剔除了结合蛋白的话,研究者就能抑制病毒的复制,相关信息或能帮助研究人员识别潜在的抗病毒药物靶点。

此外,很多lncRNAs也能被用作癌症的诊断生物标志物,因为相比正常细胞而言,其在癌细胞中水平非常高,CARPID技术还能被用来检测癌细胞中这些lncRNAs的结合蛋白,这或许就能帮助阐明潜在的致癌机制以及后期用来开发癌症诊断技术和新型疗法的潜在蛋白靶点。最后研究者表示,他们花费了一年时间来开发CARPID技术,大部分实验都是在香港城市大学进行的,下一步他们还将或继续对干细胞和DANCR进行深入研究,DANCR是一种能作为肿瘤促进子的lncRNA。(生物谷Bioon.com)

参考资料:

【1】CRISPR-assisted novel method detects RNA-binding proteins in living cells

【2】Yi, W., Li, J., Zhu, X. et al. CRISPR-assisted detection of RNA–protein interactions in living cells. Nat Methods 17, 685–688 (2020). doi:10.1038/s41592-020-0866-0

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