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突破!Nature领衔两项研究快速重建SARS-CoV-2病毒!

来源:本站原创 2020-05-26 08:49

2020年5月26日讯 /生物谷BIOON /——根据Nature杂志近日发表的一篇文章,研究人员已经利用啤酒酵母中的人工染色体产生出了新型冠状病毒全基因组的克隆。尽管其他实验室正在或者已经通过其他方法构建出了SARS-CoV-2的克隆,研究人员表示酵母系统的主要好处是它的速度和稳定性。

"酵母令人兴奋的地方在于……它很快"宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的微生物学家和冠状病毒专家Susan Weiss说。她不是该研究小组的成员。"其他的方法是繁琐和困难的。"

重建和修改致病病毒的基因组是许多病毒学研究的起点。这些基因操作对于研究病毒的感染方法、复制过程、可能对抗病毒的药物以及潜在的疫苗是至关重要的。

图片来源:ANDREW HEMPHILL, BEATRICE FREY, UNIVERSITY OF BERN

曼尼托巴大学的病毒学家Darwyn Kobasa没有参与这项研究,他说,在新病毒爆发和大流行期间,克隆的"速度是关键",特别是如果出现新的变异的时候。他补充说,这项新技术的速度"确实令人印象深刻"。

伯尔尼大学的共同作者Volker Thiel说:"我们的目的是了解这种病毒"及其弱点。就像世界各地从事此类研究的科学家一样,Thiel和他的团队在一个高防护设施中工作,该设施具有严格的生物安全和安全规程,旨在保护研究人员并防止任何病毒的意外释放。

可能最广泛使用的病毒基因组克隆方法是将DNA片段整合在一起,并将其引入大肠杆菌中进行复制。但是对于一些病毒,包括冠状病毒,这种方法可能会有问题。"首先,(冠状病毒)有非常大的基因组," Thiel说,这使得细菌很难完全负载它们,而且,基因组的某些部分是不稳定的,或者可能对细菌有毒,原因尚不完全清楚。

因为酵母细胞比细菌大,它们可以处理更大的DNA片段。同样来自伯尔尼大学的合着者Joerg Jores说,还有一个很大的优势。酵母细胞具有将DNA片段组装成一个大分子的固有能力。

Weiss说,这意味着,在将病毒DNA导入细胞之前,你不需要先重建病毒DNA,而是"将所有这些片段放入酵母中,然后神奇地将它们组合在一起"。

此自动片段组装是前面描述的克隆方法的核心,该方法称为转换关联重组(transformation associated recombination, TAR)。为了重建SARS-CoV-2, Thiel、Jores和同事生成了代表整个病毒基因组的14个DNA片段(有些是从病毒RNA扩增而来,有些是合成的)。每个片段与下一个片段共享一个重叠的短区域,这样酵母细胞就可以识别出哪一个末端是匹配的。基因组的两端片段还与一个质粒载体共享重叠序列,该质粒载体将包含病毒基因组并允许其形成酵母人工染色体(YAC)。这种粘合过程被称为同源重组,它包括将一条DNA链末端的核苷酸修剪掉,并将剩余的互补序列(重叠部分)退火与另一个片段结合。

Jores说:"这些细胞将DNA自己重新组合成一台YAC的能力令人惊叹。"

他的团队将这些片段导入酿酒酵母的细胞中,并在两天后挑选并测试菌落是否存在完整的基因组。从这些克隆体中提取的DNA在体外转录,然后产生RNA,用于感染培养的哺乳动物细胞。从将DNA导入酵母到恢复传染性RNA病毒只用了一周时间。他们说,研究小组还克隆了一个编码荧光报告基因的SARS-CoV-2版本,用于高通量药物筛选。

最近发表在Cell Host & Microbe杂志上的一篇论文报道了通过一种称为体外键合的方法构建完整长度的SARS-CoV-2基因组。Thiel说,这种方法也"相当快",但"仍然存在在反应前使用大肠杆菌克隆单个碎片的问题"。此外,对于酵母系统,"我们有一个稳定的克隆[YAC],我们总是可以重复使用,所以我们不需要在体外键合重组"每次需要感染病毒颗粒。

图片来源:Cell Host & Microbe

Kobasa说,这项技术不仅加速了克隆过程,而且"解决了在大肠杆菌中进行克隆所固有的一些问题",例如某些DNA片段的不稳定性或毒性。

事实上,马德里国家生物技术中心的冠状病毒研究人员Luis Enjuanes正在用细菌系统克隆SARS-CoV-2,他说基因组的一个片段造成了"一点毒性"。他相信他的团队可以解决这个问题,并补充说,虽然酵母技术的速度给他留下了深刻印象,但细菌系统的一个优势是"任何人都可以做到"。"在世界上大多数分子生物学实验室,大肠杆菌的基因操作都是标准操作,而用这种使用酵母的方式则不那么普遍。"

研究人员利用TAR技术克隆了包括MERS和寨卡病毒在内的多种病毒,但他们表示,目前的工作重点是SARS-CoV-2,这并不令人意外。Thiel说:"我们每天24小时地工作,一周7天不停歇。"Jores笑着补充道:"我们正在努力拯救世界。"(生物谷Bioon.com)

参考资料:

【1】Thao, T.T.N., Labroussaa, F., Ebert, N. et al. Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9



【4】X. Xie et al., "An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2," Cell Host & Microbe, doi:10.1016/j.chom.2020.04.004, 2020.
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