Science：新技术可在体内快速进行大规模CRISPR筛选

2021年8月26日讯/生物谷BIOON/---作为一种小型的快速生长的生物，斑马鱼与人类具有很多相同的基因。斑马鱼对许多生物学家来说很重要，因为他们发现斑马鱼非常适合研究一系列问题，从有机体如何发育到神经系统如何驱动行为。如今，在一项新的研究中，来自美国犹他大学、布莱根妇女医院、哈佛医学院和麻省总医院的研究人员开发出一种名为MIC-Drop的新技术，这种技术可使斑马鱼在大规模基因研究方面将变得更加强大。相关研究结果于2021年8月19日在线发表在Science期刊上，论文标题为“MIC-Drop: A platform for large-scale in vivo CRISPR screens”。论文通讯作者为犹他大学药理学与毒理学学系化学生物学家Randall Peterson博士。

MIC-Drop可使科学家们能够有效地将CRISPR基因编辑系统部署到斑马鱼中，在一次实验中快速评估数百个基因的功能。这一进展标志着首次在动物模型中实现了使用强大的CRISPR技术进行筛选。Peterson及其研究团队使用MIC-Drop来识别对心脏健康发育和功能至关重要的几个基因。

CRISPR系统是一种可编程的修改DNA的方法。为了使用它，科学家们将一种DNA切割酶（通常是一种叫做Cas9的酶）和一种告诉这种DNA切割酶要在哪里进行切割的向导RNA（gRNA）引入细胞。这可是修改基因序列的第一步，或者简单地关闭基因。

这种方法使得对斑马鱼和其他实验室生物进行基因编辑变得更快、更便宜、更精确---但是，Peterson说，要扩大规模一次研究几个以上的基因是很困难的。为了使斑马鱼胚胎中的单个基因失活，科学家们制备了靶向该基因的gRNA，然后将它与Cas9酶混合，将混合后的溶液装入针头，并将仔细校准的溶液体积注射到胚胎中。如果他们想要在不同的胚胎中灭活不同的基因，他们必须将新的Cas9/gRNA溶液装入新的针头。Peterson说，“这个过程一直集中在单个基因或一次进行一个修改。因此，如果你想要编辑100个基因，那就是100倍的工作量。”

MIC-Drop（Multiplexed Intermixed CRISPR Droplets, 多重混合CRISPR液滴）通过将CRISPR系统的组分包装成微观的油包液滴来解决这个问题，这些油包液滴可以在不混合其内含物的情况下混合在一起。为了用MIC-Drop对许多基因进行筛选，Peterson团队首先构建出一个gRNA文库。每个gRNA与Cas9酶一起被包装在自己的液滴中。为了跟踪靶基因，每个油包液滴还包括一个识别其内含物的DNA条形码。

Peterson团队对油包液滴的化学成分进行了微调，以确保它们保持稳定和离散性，因此针对不同基因设计的油包液滴可以混合在一起并装入同一针头。在显微镜下，MIC-Drop使用者将单个油包液滴注射到斑马鱼胚胎中，然后转到下一个胚胎并注射下一个油包液滴。这个过程可以重复数百次，向每个胚胎提供一套CRISPR组分，因此在每个胚胎中，该系统都能灭活单个基因，然后这些作者监测对斑马鱼的潜在影响。

开发和优化MIC-Drop包装技术和条形码系统的博士后研究员Saba Parvez博士说，以前，在斑马鱼中对数百个基因进行CRISPR筛选，需要一个研究团队花费很多天，并需要数百根针头。他说，“如今可以把这个过程简化为一个用户在几个小时内完成。”

MIC-Drop是一种基于crispr的新技术，可以快速有效地筛选斑马鱼中数百个基因的功能，以更好地了解人类健康和疾病。图片来自Science, 2021, doi:10.1126/science.abi8870。

为了展示MIC-Drop的潜力，这些作者测试188个不同的斑马鱼基因在心脏发育中的潜在作用。在构建针对这些基因的gRNA并将CRISPR系统引入数百个斑马鱼胚胎后，他们发现有一些斑马鱼在成熟后出现了心脏缺陷。利用这些斑马鱼体内的DNA条形码，他们能够将这些缺陷追溯到13个不同基因的失活。由于斑马鱼和人类基因之间的相似性，这一发现可能指向人类心脏发育中以前未知的方面。

Peterson和Parvez渴望看到MIC-Drop在其他实验室中发挥作用，他们说筛选188个基因只是一个开始。Peterson 说，“最终，人们希望能够进行基因组规模的筛选彼得森说。我认为，有了这项技术，这种规模实际上是可以想象的。”（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Saba Parvez et al. MIC-Drop: A platform for large-scale in vivo CRISPR screens. Science, 2021, doi:10.1126/science.abi8870.