2020年5月CRISPR/Cas研究进展
来源：本站原创 2020-05-31 22:56
2020年5月31日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。 图片来自Thoma
2020年5月31日讯/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
2018年11月26日，中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改，使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵，引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究，但是更多的是质疑，甚至是谴责。
即将过去的5月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.多项研究开发出可增强基因组编辑范围的新型CRISPR/Cas9工具
doi:10.1038/s41467-020-16117-8; doi:10.1038/s41587-020-0517-0; doi:10.1126/sciadv.aau0766
CRISPR的应用范围从治疗遗传疾病到农作物的营养功效，它已经成为最有前景的基因组编辑工具之一。然而，Cas9酶依赖特定的DNA邮政编码来确定切割和编辑的位置。虽然来自酿脓链球菌的Cas9（SpCas9）受到最广泛使用，但是它需要靶位点旁边存在两个G碱基。只有不到10%的DNA序列符合这一要求。
在2020年5月发表在Nature Biotechnology期刊和Nature Communications期刊上的两项新的研究中，来自美国麻省理工学院等研究机构的研究人员成功设计出具有增强基因组编辑能力的新蛋白，从而极大地拓宽了可以准确有效地访问的DNA序列。这两项研究是由刚在麻省理工学院媒体实验室完成博士学位的Pranam Chatterjee、麻省理工学院媒体实验室副教授Joseph Jacobson与美国马萨诸塞大学医学院的研究人员合作完成的。论文标题分别为“An engineered ScCas9 with broad PAM range and high specificity and activity”和“A Cas9 with PAM recognition for adenine dinucleotides”。
这些新发现源于这些作者早期在Cas9蛋白的计算发现方面取得的突破性成就。他们从犬链球菌（Streptococcus canis）中鉴定出了Cas9（ScCas9），并在实验中对它进行了表征。虽然与SpCas9相似，但ScCas9具有更广泛地靶向DNA序列的能力。这一发现将Cas9酶可以靶向的位置从最初的基因组上的10%位点扩大到将近50%。2018年，他们在Science Advances期刊上首次报道了这些发现（Science Advances, 24 Oct 2018, doi:10.1126/sciadv.aau0766）。
为了改进ScCas9作为基因组编辑工具的功能，这些作者通过计算方法从相似的Cas9蛋白中找出了独特的部分，从而设计出ScCas9的一个优化版本，他们将它命名为Sc++。
与此同时，这些作者成功地利用他们之前开发的SPAMALOT算法，发现了需要两个A碱基而不是两个G碱基的猕猴链球菌（Streptococcus macacae）Cas9（SmacCas9）。通过结构域交换和进一步的基因改造，他们获得新的iSpyMac酶作为首批已知的不需要G碱基的Cas9编辑器之一，这样就可以进一步靶向之前无法靶向的20%的基因组。
鉴于世界各地的实验室已经开始使用这些酶成功编辑从水稻到兔子等各种有机体的基因组，因此这两项研究的下一个目标将是开发工具来靶向剩余30%的基因组序列。Chatterjee与瑞士苏黎世大学合作，正在寻求最终的进展，从而让科学家们能够靶向任何基因组序列，并在治疗遗传疾病时解决任何类型的基因突变问题。
2.FDA批准张锋领衔开发的新冠病毒CRISPR测试：1小时出结果，如验孕纸般方便！
新闻来源：SHERLOCK-based one-step test provides rapid and sensitive COVID-19 detection
张锋等人开发的基于CRISPR的新技术可以通过一步反应在一小时内提供SARS-CoV-2的检测结果，研究人员共享了实验方案和工具包，以推进研究并向临床验证迈进。美国FDA于5月6日批准了该技术作为应急测试用于临床检测新冠病毒。
来自麻省理工学院麦戈文大脑研究所、麻省理工学院和哈佛大学的布罗德研究所、Ragon研究所和霍华德休斯医学研究所的一组研究人员开发了一种新的诊断平台，名为STOP (SHERLOCK Testing in One Pot)。该测试可以在一小时内以最少的处理过程进行单步反应，这使得基于CRISPR的SHERLOCK诊断技术更接近于一种现场或家庭测试工具。它的工作原理是通过对CRISPR进行编程，在鼻、口、喉拭子或肺部液体中检测SARS-CoV-2基因物质的片段。如果发现了病毒的遗传物质，CRISPR酶就会发出荧光。
这种新测试名为"STOPCovid"，基于STOP平台。在研究中，它已被证明能够快速、准确和高度敏感地检测COVID-19病毒SARS-CoV-2，方法很简单，且只需要很少的培训，并使用简单、现成的设备，如试管和水浴。STOPCovid已在研究中得到验证，研究人员使用了诊断为COVID-19的患者的鼻咽拭子。作为原理的证明，SARS-CoV-2 RNA被添加到唾液样本中，然后用它进行检测也获得了成功。
3.Nat Med重磅！基因编辑T细胞治疗癌症是安全的！华西医院全球首个基因编辑T细胞治疗癌症的临床试验结果公布！
doi:10.1038/s41591-020-0840-5
对免疫检查点基因进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑可以提高T细胞治疗的疗效，但首先必须了解其安全性和可行性。近日发表的利用CRISPR基因编辑技术对细胞进行的首次人体试验结果表明，这种疗法是安全且持久的。
近日来自四川大学华西医院的卢铀教授领衔的研究团队在Nature Medicine上报告了全球首个基因编辑免疫细胞的临床试验结果，该研究报道了CRISPR-Cas9介导PD-1编辑的T细胞在晚期非小细胞肺癌患者中的第一期临床试验结果(ClinicalTrials.gov NCT02793856)。该研究的主要终点是安全性和可行性，次要终点是有效性。探索的目标包括追踪编辑过的T细胞。结果表明研究满足了所有预先指定的终点。
研究人员从肺癌患者身上提取了T淋巴细胞，然后利用电穿孔介导的Cas9和单导RNA质粒共转染，使这些T细胞的PD-1失效，从而在体外制造PD-1编辑的T细胞。通常情况下，PD-1蛋白会发出信号，阻止免疫细胞对人体自身组织发起攻击，而活跃的PD-1会打开癌症扩散的大门。
该研究共纳入22例患者；其中17人获得了足够的编辑T细胞进行输注，12人能够接受治疗。研究人员发现所有与治疗相关的不良事件均为1/2级。经编辑的T细胞输注后可在外周血中检测到。基因编辑后的T细胞在血液中至少停留了4周，这表明这种策略可能会产生持久的效果。
这些病人的中位无进展生存期为7.7周(95%置信区间，6.9 - 8.5周)，中位总生存期为42.6周(95%置信区间，10.3-74.9周)。研究人员通过对18个候选位点进行下一代测序，发现脱靶事件的中位突变频率为0.05%(范围为0-0.25%)。
4.Nature：鉴别出新型T细胞免疫疗法靶点 有望帮助开发抵御癌症和自身免疫性疾病的新型疗法
doi:10.1038/s41586-020-2246-4
近日，一项刊登在国际杂志Nature上题为“CRISPR screen in regulatory T cells reveals modulators of Foxp3”的研究报告中，来自加利福尼亚大学等机构的科学家们通过研究表示，对调节性T细胞进行CRISRP筛选或有望揭示Foxp3分子的调节子，Foxp3是控制Treg细胞（调节性T细胞）发育和功能的关键转录因子之一，它的是Treg免疫生物学重要的进步，也为科学家们进一步了解Treg功能和作用机制打开了一扇“门”。
这项研究中，研究人员开发出了一种用于初级小鼠Treg细胞表型研究的基于CRISPR的联合筛选平台，同时研究人员利用该技术对大约500和核因子进行了靶向功能缺失的筛选分析，从而识别出能促进或干扰Foxp3表达的基因调节程序。研究者Jessica T. Cortez说道，我们发现了多个Foxp3表达的调节子，其中就包括泛素特异性肽酶22（Usp22）和环指蛋白20（Rnf20）；Usp22是SAGA染色质修饰复合体去泛素化模块的成员，其能作为一种正向调节因子来稳定Foxp3的表达，然而，筛选结果表明，作为E3泛素连接酶，Rnf20能够成为Foxp3的负向调节子。
研究者表示，在小鼠机体中对Usp22进行Treg特异性地剔除或能降低Foxp3蛋白的水平并诱发其抑制性功能的缺失，从而导致自发性自身免疫反应的产生，但在多种癌症模型中却能保护机体抵御肿瘤的生长；在Usp22缺失的Treg细胞中，Foxp3的不稳定或能被Rnf20的剔除来拯救，这就揭示了Treg细胞中或许存在一种相互的泛素化开关。
5.Nature重大突破：利用CRISPR实现病毒高通量检测，一次检测169种病毒！
doi:10.1038/s41586-020-2279-8
研究人员已经开发出一种新技术，可以灵活地扩展基于CRISPR的分子诊断学，使用微流体芯片可以同时运行数千个测试。单片芯片的能力范围可以从一次在1000多个样本中检测一种单一类型的病毒，到在少量样本中搜索160多种不同的病毒，包括COVID-19病毒。
这项技术被称为核酸多重评估的组合排列反应(Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids，CARMEN)，研究人员在病人样本上进行了验证，当天就能得到结果，将来有一天可能会用于广泛的公共卫生工作。
这项研究成果发表在Nature杂志上，由麻省理工学院Broad研究所和哈佛大学博士后Cheri Ackerman和Cameron Myhrvold共同领导。Broad研究所核心成员、麻省理工学院生物工程系副教授Paul Blainey和哈佛大学教授、Broad研究所成员以及霍华德·休斯医学研究所研究员Pardis Sabeti是这篇文章的共同通讯作者。
6.Disease Models & Mechanisms:研究揭示罕见病的遗传机制
doi:10.1242/dmm.041913
在最近一项研究中，来自弗吉尼亚理工大学的研究者们通过遗传学手段将一种罕见的人类疾病与PHETA1基因突变联系起来。
通过在斑马鱼中使用CRISPR基因组编辑和其他研究工具，科学家发现斑马鱼的PHETA1同源蛋白对于斑马鱼的肾功能和颅面发育至关重要。该研究发表在最新一期的《Disease Models and Mechanisms》上。
研究作者，生物医学研究所副教授Albert Pan与美国国立卫生研究院（NIH）团队合作，研究了与患者相关的突变可能如何影响其临床表型。
在人类患者中，PHETA1突变会造成发育迟缓，面部和肾脏异常，其PHETA1蛋白发生突变。研究人员在斑马鱼中构建了类似的突变，发现它们与OCRL（Lowe综合征的致病蛋白）存在有害相互作用。
缺乏类似PHETA1的蛋白质会导致斑马鱼的肾脏生理功能和颅面发育受损，类似于患者的肾脏和颅面特征。斑马鱼的颅面缺陷可能是由组织蛋白酶K失调引起的，该酶负责降解胶原蛋白，并在骨质疏松症中起作用。
在基因组分析，蛋白质建模，颅面发育的研究过程中，许多研究小组进行了合作。Pan说：“这是一个复杂的，跨学科的项目，最终融合在一起。我们将个体的表型与潜在的基因联系在一起。我们为医学科学家提供了定义常见综合征的起点，并发展了预防和治疗方法。”（生物谷 Bioon.com）
图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。
即将过去的5月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.多项研究开发出可增强基因组编辑范围的新型CRISPR/Cas9工具
doi:10.1038/s41467-020-16117-8; doi:10.1038/s41587-020-0517-0; doi:10.1126/sciadv.aau0766
CRISPR的应用范围从治疗遗传疾病到农作物的营养功效，它已经成为最有前景的基因组编辑工具之一。然而，Cas9酶依赖特定的DNA邮政编码来确定切割和编辑的位置。虽然来自酿脓链球菌的Cas9（SpCas9）受到最广泛使用，但是它需要靶位点旁边存在两个G碱基。只有不到10%的DNA序列符合这一要求。
在2020年5月发表在Nature Biotechnology期刊和Nature Communications期刊上的两项新的研究中，来自美国麻省理工学院等研究机构的研究人员成功设计出具有增强基因组编辑能力的新蛋白，从而极大地拓宽了可以准确有效地访问的DNA序列。这两项研究是由刚在麻省理工学院媒体实验室完成博士学位的Pranam Chatterjee、麻省理工学院媒体实验室副教授Joseph Jacobson与美国马萨诸塞大学医学院的研究人员合作完成的。论文标题分别为“An engineered ScCas9 with broad PAM range and high specificity and activity”和“A Cas9 with PAM recognition for adenine dinucleotides”。
图片来自Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-16117-8。
这些新发现源于这些作者早期在Cas9蛋白的计算发现方面取得的突破性成就。他们从犬链球菌（Streptococcus canis）中鉴定出了Cas9（ScCas9），并在实验中对它进行了表征。虽然与SpCas9相似，但ScCas9具有更广泛地靶向DNA序列的能力。这一发现将Cas9酶可以靶向的位置从最初的基因组上的10%位点扩大到将近50%。2018年，他们在Science Advances期刊上首次报道了这些发现（Science Advances, 24 Oct 2018, doi:10.1126/sciadv.aau0766）。
为了改进ScCas9作为基因组编辑工具的功能，这些作者通过计算方法从相似的Cas9蛋白中找出了独特的部分，从而设计出ScCas9的一个优化版本，他们将它命名为Sc++。
与此同时，这些作者成功地利用他们之前开发的SPAMALOT算法，发现了需要两个A碱基而不是两个G碱基的猕猴链球菌（Streptococcus macacae）Cas9（SmacCas9）。通过结构域交换和进一步的基因改造，他们获得新的iSpyMac酶作为首批已知的不需要G碱基的Cas9编辑器之一，这样就可以进一步靶向之前无法靶向的20%的基因组。
鉴于世界各地的实验室已经开始使用这些酶成功编辑从水稻到兔子等各种有机体的基因组，因此这两项研究的下一个目标将是开发工具来靶向剩余30%的基因组序列。Chatterjee与瑞士苏黎世大学合作，正在寻求最终的进展，从而让科学家们能够靶向任何基因组序列，并在治疗遗传疾病时解决任何类型的基因突变问题。
2.FDA批准张锋领衔开发的新冠病毒CRISPR测试：1小时出结果，如验孕纸般方便！
新闻来源：SHERLOCK-based one-step test provides rapid and sensitive COVID-19 detection
张锋等人开发的基于CRISPR的新技术可以通过一步反应在一小时内提供SARS-CoV-2的检测结果，研究人员共享了实验方案和工具包，以推进研究并向临床验证迈进。美国FDA于5月6日批准了该技术作为应急测试用于临床检测新冠病毒。
来自麻省理工学院麦戈文大脑研究所、麻省理工学院和哈佛大学的布罗德研究所、Ragon研究所和霍华德休斯医学研究所的一组研究人员开发了一种新的诊断平台，名为STOP (SHERLOCK Testing in One Pot)。该测试可以在一小时内以最少的处理过程进行单步反应，这使得基于CRISPR的SHERLOCK诊断技术更接近于一种现场或家庭测试工具。它的工作原理是通过对CRISPR进行编程，在鼻、口、喉拭子或肺部液体中检测SARS-CoV-2基因物质的片段。如果发现了病毒的遗传物质，CRISPR酶就会发出荧光。
这种新测试名为"STOPCovid"，基于STOP平台。在研究中，它已被证明能够快速、准确和高度敏感地检测COVID-19病毒SARS-CoV-2，方法很简单，且只需要很少的培训，并使用简单、现成的设备，如试管和水浴。STOPCovid已在研究中得到验证，研究人员使用了诊断为COVID-19的患者的鼻咽拭子。作为原理的证明，SARS-CoV-2 RNA被添加到唾液样本中，然后用它进行检测也获得了成功。
3.Nat Med重磅！基因编辑T细胞治疗癌症是安全的！华西医院全球首个基因编辑T细胞治疗癌症的临床试验结果公布！
doi:10.1038/s41591-020-0840-5
对免疫检查点基因进行CRISPR-Cas9介导的基因编辑可以提高T细胞治疗的疗效，但首先必须了解其安全性和可行性。近日发表的利用CRISPR基因编辑技术对细胞进行的首次人体试验结果表明，这种疗法是安全且持久的。
近日来自四川大学华西医院的卢铀教授领衔的研究团队在Nature Medicine上报告了全球首个基因编辑免疫细胞的临床试验结果，该研究报道了CRISPR-Cas9介导PD-1编辑的T细胞在晚期非小细胞肺癌患者中的第一期临床试验结果(ClinicalTrials.gov NCT02793856)。该研究的主要终点是安全性和可行性，次要终点是有效性。探索的目标包括追踪编辑过的T细胞。结果表明研究满足了所有预先指定的终点。
研究人员从肺癌患者身上提取了T淋巴细胞，然后利用电穿孔介导的Cas9和单导RNA质粒共转染，使这些T细胞的PD-1失效，从而在体外制造PD-1编辑的T细胞。通常情况下，PD-1蛋白会发出信号，阻止免疫细胞对人体自身组织发起攻击，而活跃的PD-1会打开癌症扩散的大门。
该研究共纳入22例患者；其中17人获得了足够的编辑T细胞进行输注，12人能够接受治疗。研究人员发现所有与治疗相关的不良事件均为1/2级。经编辑的T细胞输注后可在外周血中检测到。基因编辑后的T细胞在血液中至少停留了4周，这表明这种策略可能会产生持久的效果。
这些病人的中位无进展生存期为7.7周(95%置信区间，6.9 - 8.5周)，中位总生存期为42.6周(95%置信区间，10.3-74.9周)。研究人员通过对18个候选位点进行下一代测序，发现脱靶事件的中位突变频率为0.05%(范围为0-0.25%)。
4.Nature：鉴别出新型T细胞免疫疗法靶点 有望帮助开发抵御癌症和自身免疫性疾病的新型疗法
doi:10.1038/s41586-020-2246-4
近日，一项刊登在国际杂志Nature上题为“CRISPR screen in regulatory T cells reveals modulators of Foxp3”的研究报告中，来自加利福尼亚大学等机构的科学家们通过研究表示，对调节性T细胞进行CRISRP筛选或有望揭示Foxp3分子的调节子，Foxp3是控制Treg细胞（调节性T细胞）发育和功能的关键转录因子之一，它的是Treg免疫生物学重要的进步，也为科学家们进一步了解Treg功能和作用机制打开了一扇“门”。
图片来源：Frontiers。
这项研究中，研究人员开发出了一种用于初级小鼠Treg细胞表型研究的基于CRISPR的联合筛选平台，同时研究人员利用该技术对大约500和核因子进行了靶向功能缺失的筛选分析，从而识别出能促进或干扰Foxp3表达的基因调节程序。研究者Jessica T. Cortez说道，我们发现了多个Foxp3表达的调节子，其中就包括泛素特异性肽酶22（Usp22）和环指蛋白20（Rnf20）；Usp22是SAGA染色质修饰复合体去泛素化模块的成员，其能作为一种正向调节因子来稳定Foxp3的表达，然而，筛选结果表明，作为E3泛素连接酶，Rnf20能够成为Foxp3的负向调节子。
研究者表示，在小鼠机体中对Usp22进行Treg特异性地剔除或能降低Foxp3蛋白的水平并诱发其抑制性功能的缺失，从而导致自发性自身免疫反应的产生，但在多种癌症模型中却能保护机体抵御肿瘤的生长；在Usp22缺失的Treg细胞中，Foxp3的不稳定或能被Rnf20的剔除来拯救，这就揭示了Treg细胞中或许存在一种相互的泛素化开关。
5.Nature重大突破：利用CRISPR实现病毒高通量检测，一次检测169种病毒！
doi:10.1038/s41586-020-2279-8
研究人员已经开发出一种新技术，可以灵活地扩展基于CRISPR的分子诊断学，使用微流体芯片可以同时运行数千个测试。单片芯片的能力范围可以从一次在1000多个样本中检测一种单一类型的病毒，到在少量样本中搜索160多种不同的病毒，包括COVID-19病毒。
这项技术被称为核酸多重评估的组合排列反应(Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids，CARMEN)，研究人员在病人样本上进行了验证，当天就能得到结果，将来有一天可能会用于广泛的公共卫生工作。
这项研究成果发表在Nature杂志上，由麻省理工学院Broad研究所和哈佛大学博士后Cheri Ackerman和Cameron Myhrvold共同领导。Broad研究所核心成员、麻省理工学院生物工程系副教授Paul Blainey和哈佛大学教授、Broad研究所成员以及霍华德·休斯医学研究所研究员Pardis Sabeti是这篇文章的共同通讯作者。
6.Disease Models & Mechanisms:研究揭示罕见病的遗传机制
doi:10.1242/dmm.041913
在最近一项研究中，来自弗吉尼亚理工大学的研究者们通过遗传学手段将一种罕见的人类疾病与PHETA1基因突变联系起来。
通过在斑马鱼中使用CRISPR基因组编辑和其他研究工具，科学家发现斑马鱼的PHETA1同源蛋白对于斑马鱼的肾功能和颅面发育至关重要。该研究发表在最新一期的《Disease Models and Mechanisms》上。
图片来源：Www.pixabay.com。
研究作者，生物医学研究所副教授Albert Pan与美国国立卫生研究院（NIH）团队合作，研究了与患者相关的突变可能如何影响其临床表型。
在人类患者中，PHETA1突变会造成发育迟缓，面部和肾脏异常，其PHETA1蛋白发生突变。研究人员在斑马鱼中构建了类似的突变，发现它们与OCRL（Lowe综合征的致病蛋白）存在有害相互作用。
缺乏类似PHETA1的蛋白质会导致斑马鱼的肾脏生理功能和颅面发育受损，类似于患者的肾脏和颅面特征。斑马鱼的颅面缺陷可能是由组织蛋白酶K失调引起的，该酶负责降解胶原蛋白，并在骨质疏松症中起作用。
在基因组分析，蛋白质建模，颅面发育的研究过程中，许多研究小组进行了合作。Pan说：“这是一个复杂的，跨学科的项目，最终融合在一起。我们将个体的表型与潜在的基因联系在一起。我们为医学科学家提供了定义常见综合征的起点，并发展了预防和治疗方法。”（生物谷 Bioon.com）
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