CAR-T细胞疗法研究进展（第8期）

2019年7月31日讯/生物谷BIOON/---CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。

这种新的治疗策略的关键之处在于识别靶细胞的被称作嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）的人工受体，而且在经过基因修饰后，病人T细胞能够表达这种CAR。在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体。这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。这些T细胞利用它们表达的CAR受体结合到靶细胞表面上的分子，而这种结合触发一种内部信号产生，接着这种内部信号如此强效地激活这些T细胞以至于它们快速地摧毁靶细胞。

近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。基于此，针对CAR-T细胞疗法取得的最新进展，小编进行一番盘点，以飨读者。

1.Nat Biotechnol：新型CAR-T细胞疗法高效攻击致命性脑瘤，可清除80%的肿瘤
doi:10.1038/s41587-019-0192-1

在一项新的研究中，来自美国麻省总医院和哈佛医学院的研究人员发现一种令人兴奋的新型癌症免疫疗法对患有胶质母细胞瘤（一种最常见和最致命的脑癌类型）的患者有疗效。他们构建出的一种新方法可能让免疫疗法再次变得对脑瘤有效，而且这可能有助于利用它治疗其他类型的实体瘤。相关研究结果于2019年7月22日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“CAR-T cells secreting BiTEs circumvent antigen escape without detectable toxicity”。

这种称为嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）的免疫疗法涉及收集患者体内具有免疫攻击性的T细胞，并对它们进行基因修饰，使得它们能够识别肿瘤表面上的特定靶标（抗原），然后将它们灌注回相同患者体内。

论文通讯作者、麻省总医院细胞免疫治疗主任、哈佛医学院医学助理教授Marcela V. Maus博士解释道，常规抗癌药很难治疗诸如胶质母细胞瘤之类的实体瘤，这是因为大多数药物分子都太大而无法穿过血脑屏障，而且免疫疗法在这方面也存在问题。

Maus说道，“我们之前制造出治疗胶质母细胞瘤的CAR-T细胞，胶质母细胞瘤面临的挑战之一就是并非所有的肿瘤细胞都能表达T细胞能够靶向的靶标。”它们的靶标是表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII），这是一种突变的致癌蛋白，存在于许多但并非所有胶质母细胞瘤的表面。

因此，为了提高CAR-T细胞的疗效，他们决定靶向第二种抗原，即天然存在的EGFR，或者说“野生型”EGFR。但是鉴于EGFR存在于体内许多细胞中，因此靶向这种蛋白的药物可引起严重的副作用。为了克服这种毒性问题，Maus及其同事们构建出一种可被递送到大脑底部的脑脊液中的CAR-T细胞。当进入大脑中时，这种CAR-T细胞随后分泌第二种类型的免疫治疗分子，称为双特异性T细胞衔接蛋白（bi-specific T-cell engager, BiTE）。BiTE是将细胞杀伤性的T细胞引导至特定靶标的抗体，这有点类似于所谓的“智能炸弹”上的自动引导装置。

虽然BiTE比抗体类药物小，但是如果进行静脉注射的话，那么BiTE仍然太大而无法穿过血脑屏障，因此他们构建出的分泌BiTE 的CAR-T构建体“能够通过靶向第二种抗原产生局部肿瘤效应，这是一种克服这种肿瘤异质性并且能够一次性靶向两种物质的方法。但是，鉴于它是在血脑屏障的另一侧少量产生的，它不会对其他器官造成毒性”。当在人胶质母细胞瘤模型中进行测试时，他们发现这些经过基因改进的分泌BiTE的CAR-T细胞消除了大约80％的肿瘤。

2.Science子刊：酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼作为CAR-T细胞的药物开关
doi:10.1126/scitranslmed.aau5907

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞免疫疗法是一种有效治疗癌症的细胞疗法。不幸的是，这种免疫疗法有它的风险，而且CAR-T细胞的过度活化有时会引起严重甚至致命的毒副作用。CAR-T细胞是“活的药物”，需要采取技术允许医生（和患者）保持对注入到患者体内的这些T细胞的控制。目前有一些抑制过度活化的CAR-T细胞的方法，它们能够杀死CAR-T细胞，因而消除它们的毒副作用和抗肿瘤作用，但是它们都是一次性使用的。

在一项新的研究中，来自德国维尔茨堡大学医院和美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究人员证实酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（dasatinib）干扰淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, LCK），抑制CD3ζ和T细胞受体相关蛋白激酶70 kDa（ZAP70）ζ链的磷酸化，从而清除含有CD28_CD3ζ或4-1BB_CD3ζ活化模块的CAR构造体中的信号转导。因此，达沙替尼在CD8+和CD4+ CAR-T细胞中诱导一种功能关闭状态，而且这是立即起效的，能够持续数天而不影响T细胞的活力。相关研究结果发表在2019年7月3日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“The tyrosine kinase inhibitor dasatinib acts as a pharmacologic on/off switch for CAR T cells”。

这些研究人员发现不论是在体外还是在体内，用达沙替尼进行处理可阻止CAR-T细胞的细胞溶解活性、细胞因子产生和增殖。达沙替尼的剂量经滴定后能够部分或完全抑制CAR-T细胞的功能。在停用达沙替尼后，它的抑制作用快速地和完全地受到逆转，而且CAR-T细胞重新发挥它们的抗肿瘤功能。达沙替尼的有利药效学特性可用于实时控制CAR-T细胞在“功能开启-关闭-开启（function-on-off-on）”序列中的活性。

在细胞因子释放综合征（CRS）的小鼠模型中，这些研究人员证实在CAR-T细胞输注后较早地进行较短的达沙替尼处理可保护一部分小鼠免受致命性的细胞因子释放综合征。这些数据表明可引入达沙替尼作为CAR-T细胞的一种广泛适用的药物开启/关闭开关。

3.Science：重磅！利用疫苗增强CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效，可完全清除60%小鼠体内的实体瘤
doi:10.1126/science.aav8692

一种有希望的治疗某些类型癌症的新方法是对患者自身的T细胞进行编程，使得它们能够破坏癌细胞。这种称为CAR-T细胞疗法的方法目前可用于抵抗某些类型的白血病，但是到目前为止它还不能很好地治疗实体瘤，如肺肿瘤或乳腺肿瘤。

如今，在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院的研究人员开发出一种新的方法对这种疗法进行改进，使得它可用作一种抵抗几乎任何癌症类型的武器。具体而言，他们开发出一种疫苗，它可显著地增强抗肿瘤T细胞群体，并且允许这些T细胞大力地侵入实体瘤中。相关研究结果发表在2019年7月12日的Science期刊上，论文标题为“Enhanced CAR–T cell activity against solid tumors by vaccine boosting through the chimeric receptor”。

在一项针对小鼠的研究中，这些研究人员发现他们能够完全清除60%的在接受CAR-T细胞治疗的同时还接受了强化疫苗接种的小鼠体内的实体瘤。在治疗实体瘤时，这些接受基因改造的T细胞独自地几乎没有效果。

论文通讯作者、麻省理工学院科赫综合癌症研究所副主任Darrell Irvine说道，“通过添加一种疫苗，对存活没有影响的CAR-T细胞治疗经这种疫苗强化后可导致一半以上的小鼠发生完全缓解。”此外，论文第一作者为麻省理工学院博士后研究员Leyuan Ma。

4.PNAS：靶向TOX和TOX2有望改善CAR-T细胞免疫疗法对实体瘤的治疗
doi:10.1073/pnas.1905675116

十年前，科学家们已宣布开发出一种称为CAR（嵌合抗原受体）-T的癌症免疫疗法：对来自患者的T细胞进行基因修饰，使得它们具有强大的抗肿瘤作用，随后再将这些经过基因修饰的T细胞灌注到患者自己的体内。从那以后，CAR-T方法（统称为“过继性T细胞转移”的几种策略中的一种）作为新型细胞免疫治疗工具成为头条新闻。迄今为止，它们最为成功地用于对抗所谓的“液体癌症（liquid cancer）”，如白血病和淋巴瘤。

肉瘤和癌症对这些方法更有抵抗力，这部分上是因为经过基因修饰的T细胞一旦浸润到肿瘤中就逐渐地失去抗肿瘤能力。免疫学家将这种细胞疲劳称为T细胞“衰竭（exhaustion）”或“功能障碍（dysfunction）”。为了理解其中的原因，美国拉荷亚免疫学研究所的Anjana Rao博士和Patrick Hogan博士在过去几年中发表了一系列论文，报道了一种称为NFAT的调节基因表达的转录因子开启削弱T细胞抗肿瘤反应的“下游”基因表达，因而导致T细胞衰竭。其中的一组下游基因编码转录因子NR4A，而且前研究生Joyce Chen已发现通过基因手段清除肿瘤浸润CAR-T细胞中的NR4A蛋白可改善肿瘤排斥。然而，在这个途径中与NFAT和NR4A发挥协同作用的其他参与者的身份仍然未知。

如今，在一项新的研究中，Rao实验室和Hogan实验室在一个建立并维持T细胞衰竭的广泛基因表达网络中，提供了一个更为完整的参与者列表。这项研究利用小鼠模型发现通过基因手段清除两个新的转录因子--- TOX和TOX2---也会改善CAR-T方法中对“实体”黑色素瘤的根除。它表明在患者中靶向NR4A和TOX因子的类似干预措施可能将基于CAR-T的免疫疗法的应用扩展到实体瘤中。相关研究结果于2019年5月31日在线发表在PNAS期刊上，论文标题为“TOX and TOX2 transcription factors cooperate with NR4A transcription factors to impose CD8+ T cell exhaustion”。

他们首先比较了正常的与“衰竭的”T细胞样本中的基因表达谱，寻找与NR4A同时上调的因子作为T细胞功能障碍的同谋者。论文第一作者、Rao实验室博士后研究员Hyungseok Seo博士说道，“我们发现两种称为TOX和TOX2的DNA结合蛋白与NR4A转录因子一起高度表达。这一发现表明诸如NFAT或NR4A之类的因子可能会控制TOX的表达。”

值得注意的是，相比于接受正常的T细胞灌注的小鼠，接受缺乏TOX的CAR-T细胞灌注的小鼠显示出更为强烈的黑色素瘤消退。此外，接受缺乏TOX的CAR-T细胞治疗的小鼠表现出显著增加的存活率，这就表明TOX因子的缺乏对抗T细胞衰竭并且允许T细胞更有效地破坏肿瘤细胞。

5.Front Immunol：如何增强杀伤性T细胞破坏癌细胞的能力？
doi:10.3389/fimmu.2019.01321

日前，一篇发表在国际杂志Frontiers in Immunology上的研究报告中，来自卡迪夫大学的科学家们通过研究发现，很多类型的癌症或能被患者自身的免疫细胞所破坏，研究者指出，增加T细胞中L-选择蛋白（L-selectin）的水平就能明显改善患者机体抵御实体瘤的能力。

研究者Ann Ager说道，本文研究结果表明，免疫疗法或有望用来治疗多种癌症类型，这或许对很多人而言是一个好效益，因为免疫疗法更具针对性，且并不会损伤机体的健康细胞。截至目前为止，能调节患者自身T细胞的免疫疗法在临床试验中能用来帮助治疗特性白血病的患者，在这些患者中，癌细胞常常在血液中循环，对于诸如CAR-T细胞等癌症靶向免疫细胞而言能够更加轻松地寻找并且攻击癌细胞，由于实体瘤的血流量很差，而且肿瘤内部的血管并没有正常形成，因为科学家们治疗实体瘤要困难地多。

研究者表示，L-选择蛋白是T细胞中的重要归巢分子，其能指挥细胞自身在血液中的移动以及进入炎性组织，因此研究者就想通过研究阐明增加抗癌T细胞中L-选择蛋白的水平是否能够改善对癌症的抵抗力，并有效杀灭癌细胞。研究结果表明，增加L-选择蛋白的水平的确能够提高T细胞对实体瘤的能力，但这并不是因为细胞出现了较好的归巢作用，被修饰的T细胞能在开始第一个小时内进入到实体瘤中，在超过一周的时间里其会保持在实体瘤中不断循环，这就表明，在癌症中，L-选择蛋白在抗癌T细胞的激活和保留上扮演着非常关键的角色。

6.Adv Mat：CAR T治疗实体瘤取得突破！华人学者利用光热疗法突破实体瘤障碍！
doi:10.1002/adma.201900192

加州大学洛杉矶分校（UCLA）Jonsson综合癌症研究所的科学家领导的一项临床前研究表明，在CAR T细胞治疗期间加热实体肿瘤可以提高治疗的成功率。研究人员发现，将光热消融的加热技术与CAR T细胞灌注结合在一起，可以抑制小鼠黑色素瘤的生长长达20天。在接受联合治疗的小鼠中，33%的小鼠在20天后仍然没有肿瘤。

用嵌合抗原受体(CAR)进行基因工程的T细胞已成功地用于治疗许多淋巴瘤和白血病患者。但是CAR T细胞疗法在治疗实体肿瘤方面效果不太好，这是因为实体肿瘤有一个保护性的微环境，这使得CAR T细胞更难进入肿瘤并保持T细胞活性。UCLA的科学家们决定测试CAR T疗法与光热疗法结合是否能克服这个障碍。光热疗法是一种利用激光能量的热量杀死癌细胞的微创技术;它已经被用于治疗各种癌症和其他疾病。

研究人员测试了大约40摄氏度的轻度热疗是否可以帮助CAR T细胞更有效地攻击肿瘤。UCLA领导的研究小组在注射了人类黑色素瘤的老鼠身上测试了这项技术。研究人员将光热剂注入肿瘤，然后用激光照射使其升温。然后，静脉注射CAR T细胞。利用激光将肿瘤温度提高到40摄氏度左右，有助于肿瘤相关血管的扩张，同时可以促进T细胞生长。

该技术通过增强CAR T细胞治疗的能力，最终可以改善难以治疗的实体肿瘤患者的预后。研究人员将继续在动物身上测试这一策略，以优化加热时间和温度，然后再决定是否可以在人体进行测试。UCLA Samueli工程学院生物工程学教授、Jonsson癌症中心成员、UCLA纳米系统研究所成员顾臻教授是这项研究的共同通讯作者，论文的另一位通讯作者是北卡罗来纳大学教堂山分校的Gianpietro Dotti博士，该论文第一作者是顾教授实验室博士后研究员陈倩博士。该研究发表在《Advanced Materials》上。

7.Nat Med重大突破！北大开发更安全的新型CAR T疗法
doi:10.1038/s41591-019-0421-7

CAR T疗法近日取得了重大突破，来自北京大学肿瘤医院的朱军教授团队和南加州大学Si-Yi Chen教授团队合作在Nature Medicine上发表了最新研究，表明他们的新方法可以消除CAR T疗法的严重副作用，使得这种疗法更加安全。

“这是一个重大突破。”南加州大学Norris癌症综合中心的Si-Yi Chen教授说道。“我们创造了一个全新的CAR 分子，可以有效杀伤癌细胞，但是发挥作用的速度更慢，毒副作用更小。”在25名淋巴瘤病人身上进行的实验表明这种改进版的CAR T疗法不会产生严重副作用。尽管这项研究的目的是测试这种CAR T 疗法的安全性，但是11名接受常规剂量治疗的病人中有6名病人已经进入完全消退期。

CAR T疗法通过将病人血液中的T细胞分离后进行工程化处理，使其表面携带嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors， CARs），随后这些细胞被回输到病人血液中，它们可以识别并杀伤癌细胞。这种疗法已经被FDA批准一年多，事实证明它是一部分白血病和淋巴瘤病人的救命稻草，给那些濒临死亡的病人带来了持久的疾病消退。但是这种疗法常常会产生严重甚至致命的副作用。这些副作用主要由于CAR T细胞在血液中快速增殖并释放大量细胞因子产生，严重的细胞因子释放综合征会导致致命的多器官损伤和脑水肿。

而在这个最新的CAR版本中，研究人员调整了CAR 的序列和形状，使得这些CAR T细胞可以杀伤癌细胞，但是产生的细胞因子更少，增殖速度更慢，因此血液有足够的时间清除细胞因子。

“这个改进版的CAR T细胞可以在病人体内增殖并分化为记忆细胞，因此会产生强烈而持久的抗癌效应，同时我不会引起毒副作用。”Chen说道。“毒副作用是现在CAR T疗法面临的最大问题，我们希望这种改进版的CAR T疗法可以用于治疗门诊病人。”

8.PNAS：基于纳米抗体的CAR-T细胞有望治疗实体瘤
doi:10.1073/pnas.1817147116

1989年，比利时布鲁塞尔自由大学的两名本科生被要求测试骆驼的冷冻血清，偶然间发现了一类以前未知的抗体。它是人体抗体的小型化版本，仅由两条重蛋白链组成，而不是由两条轻链和两条重链组成。正如他们最终报道的那样，这类抗体的存在不仅在骆驼中得到证实，而且也在美洲驼和羊驼中得到证实。

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法具有很高的治疗血癌的前景，它通过对患者自身的T细胞进行基因改造，使得它们更好地攻击癌细胞。比如，达纳-法伯/波士顿儿童癌症癌症与血液疾病中心当前正在利用CAR-T细胞疗法治疗复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）。但是，CAR-T细胞并不擅长清除实体瘤。人们在实体瘤上很难找到可以作为安全靶标的癌症特异性蛋白。实体瘤也受到胞外基质和免疫抑制分子的保护，其中胞外基质是一种起着屏障作用的蛋白网络，免疫抑制分子削弱T细胞攻击。

30年后，在一项新的研究中，来自美国波士顿儿童医院和麻省理工学院的研究人员发现这些微型抗体（mini-antibody）经进一步缩小后可形成所谓的纳米抗体(nanobody)，可能有助于解决癌症领域的一个问题:让CAR-T细胞疗法在实体瘤中发挥作用。相关研究结果于2019年4月1日在线发表在PNAS期刊上，论文标题为“Nanobody-based CAR T cells that target the tumor microenvironment inhibit the growth of solid tumors in immunocompetent mice”。论文通讯作者为波士顿儿童医院细胞与分子医学项目免疫学家Hidde Ploegh博士。论文第一作者是波士顿儿童医院细胞与分子医学项目的研究生Yushu Joy Xie。

通过在两种不同的黑色素瘤小鼠模型中进行测试，这些基于纳米抗体的CAR-T细胞杀死肿瘤细胞，显著减缓肿瘤生长并改善这些小鼠的存活，并且没有产生明显的副作用。Ploegh认为这些经过基因改造的T细胞通过多种因素发挥作用。它们对肿瘤组织造成损伤，而这往往会刺激炎症免疫反应。靶向EIIIB可能以一种减少肿瘤血液供应的方式损害血管，同时让它们对癌症药物更具渗透性。

9.Nature：重磅！在CAR-T细胞疗法中，找到一种抵抗T细胞衰竭的新策略
doi:10.1038/s41586-019-0985-x

越来越多的癌症患者正在接受一种有前景的称为CAR-T细胞疗法的新疗法。在这种疗法中，将患者自身的T细胞从体内取出，它们经过基因改造后更好地识别癌细胞。这些经过基因改造的T细胞随后被灌注回患者体内，在那里它们发起免疫反应以摧毁癌症。CAR-T细胞疗法挽救了血癌患者的生命，但是存在一个缺点：由于一种称为T细胞衰竭（T cell exhaustion）的现象，进入实体瘤的T细胞可能停止发挥作用。

如今，在一项新的研究中，来自美国拉霍亚免疫学研究所（LJI）的研究人员找到了一种抵抗T细胞衰竭并让CAR-T细胞疗法更有效的方法。他们发现一个称为Nr4a转录因子的蛋白家族在调节与T细胞衰竭相关的基因方面起着突出作用。通过使用小鼠模型，他们证实利用缺乏Nr4a转录因子的CAR-T细胞治疗小鼠可让肿瘤缩小和提高生存率。相关研究结果于2019年2月27日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours”。论文通讯作者为拉霍亚免疫学研究所信号转导与基因表达部门的Anjana Rao博士和James P. Scott-Browne博士。

这些研究人员证实Nr4a转录因子确实在调节T细胞衰竭中发挥作用。接受Nr4a缺失的CAR-T细胞输注的大多数小鼠存活下来，而且它们的肿瘤在90天的实验过程中发生消退并保持较小的体积。相反，几乎所有接受具有天然存在的Nr4a转录因子的正常CAR-T细胞输注的小鼠在第35天死亡死于它们的肿瘤。

10.Blood：中和GM-CSF增强CAR-T细胞功能并降低它的神经毒性等副作用
doi:10.1182/blood-2018-10-881722

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是癌症治疗的新支柱，但是，因存在毒副作用，它的应用受到限制。这些毒副作用包括细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。虽然IL-6R拮抗剂托珠单抗（tocilizumab）被批准用于治疗CRS，但是目前尚没有批准的治疗与靶向CD19 的CAR-T细胞（CART19）疗法相关的神经毒性的方法。近期的数据表明单核细胞和巨噬细胞促进CAR-T细胞治疗后的CRS和神经毒性产生。

在一项新的研究中，美国梅奥诊所的研究人员研究了将中和GM-CSF（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）作为一种控制CART19细胞相关毒副作用的潜在策略。他们证实利用lenzilumab中和GM-CSF并不会在体外和体内抑制CART19细胞功能。相关研究结果发表在2019年2月14日的Blood期刊上，论文标题为“GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts”。

再者，在利用lenzilumab中和GM-CSF后，在患者来源的异种移植物中，CART19细胞增殖得到增强，并且对白血病的持久控制得到较好保持。在出现CRS和神经炎症的急性淋巴性白血病异种移植模型中，GM-CSF中和导致髓样细胞和T细胞在中枢神经系统中的浸润减少、神经炎症显著下降并阻止CRS产生。

最后，这些研究人员在CAR-T细胞制造期间通过CRISPR/Cas9破坏GM-CSF，构建出缺乏GM-CSF的CART19细胞。与正常的CART19细胞相比，这些缺乏GM-CSF的CAR-T细胞维持正常功能并且在体内具有增强的抗肿瘤活性，以及提供了总体存活率。（生物谷 Bioon.com）