EMBO Mol Med：揭示利用DR5激动剂抗体治疗三阴性乳腺癌和卵巢癌等实体瘤为何屡次遭遇失败

2021年4月20日讯/生物谷BIOON/---缺乏有效的免疫细胞浸润是实体瘤免疫治疗的重要障碍。激活实体瘤中富集的死亡受体-5（DR5）抗体，通过外部的凋亡细胞毒性作用实现肿瘤细胞减灭，仍然是一个重要的替代治疗策略，也是一种很有前景的实体瘤治疗策略。在过去的几十年里，许多DR5激动剂抗体在成功控制免疫缺陷肿瘤异种移植物中的肿瘤后进入临床试验。然而，所有临床测试的DR5激动剂抗体在实体瘤的II期临床试验中都被证明是不成功的，未能显著提高生存率。这促使人们努力开发第二代DR5激动剂，以便在肿瘤中实现超大规模的凋亡细胞毒性。由于驾驭免疫系统已成为肿瘤治疗的有力工具，在实现DR5激动剂抗体的真正临床潜力之前，仍存在一个重大问题：是否有未被发现的免疫逃避机制抵消了抗肿瘤活性，并有可能导致DR5激动剂抗体的临床失败呢？

鉴于三阴性乳腺癌（TNBC）、卵巢癌和其他实体瘤携带的PD-L1水平升高，并考虑到白蛋白结合型紫杉醇（nab-paclitaxel）和DR5激动剂联合治疗中缺乏免疫激活功能，来自美国美国弗吉尼亚大学等研究机构的研究人员在一项新的研究中，测试了一种观点，即PD-L1介导的免疫逃避是否潜在地导致DR5激动剂抗体的较低抗肿瘤反应。为此，他们使用了多种临床DR5激动剂抗体、多种实体瘤细胞系和免疫力充足的动物肿瘤模型。相关研究结果近期发表在EMBO Molecular Medicine期刊上，论文标题为“Unexpected PD-L1 immune evasion mechanism in TNBC, ovarian, and other solid tumors by DR5 agonist antibodies”。

这些作者发现在测试的实体瘤细胞系中，多种临床DR5激动剂抗体可让肿瘤细胞裂解物中的PD-L1稳定化。阻断含有caspase-8的死亡诱导信号复合物（DISC）可抑制PD-L1稳定化。相比于接受对照IgG1处理的动物，来自接受DR5激动剂抗体处理的动物的肿瘤细胞具有较高的总PD-L1表达和细胞表面PD-L1表达。

鉴于肿瘤转移和患者生存率之间呈现反比关系，这些作者接下来测试DR5抗体介导的PD-L1稳定性是否会在短暂的上皮间质转化（EMT）期间丧失。为此，他们利用肺癌细胞系A549诱导短暂的EMT，结果发现DR5的表达、对DR5激动剂的敏感性和PD-L1表面稳定化在这些转移性的转化细胞中仍然不受影响。接下来，通过持续暴露于浓度增加的来沙木单抗（lexatumumab，一种DR5激动剂抗体）3个月，他们培育出DR5抵抗性的卵巢癌细胞系和TNBC癌细胞系。在抵抗DR5信号的卵巢癌细胞系和TNBC癌细胞系中没有观察到PD-L1稳定化。

在体外经过DR5激动剂抗体处理的肿瘤细胞中，抑制多种调节翻译后PD-L1稳定性的蛋白分子，比如mTOR、STAT3、CDK1和NF‐kβ，并不改变PD-L1表面表达。此外，相比于未接受处理的肿瘤细胞，转录抑制剂（放线菌素D）和翻译抑制剂（放线菌酮）并不能逆转DR5激动剂抗体诱导的PD-L1稳定性。然而，抑制DISC-caspase-8活性会降低这些肿瘤细胞的PD-L1活性。

鉴于DR5配体Apo2L属于TNF超家族，而且TNF-α近期已被发现通过激活去泛素化酶CSN5（COP9 signalosome 5）让PD-L1稳定化，这些作者测试了DR5介导的PD-L1稳定化是否也需要CSN5。TNBC肿瘤细胞分别用DR5激动剂抗体和TNF-α处理。TNF-α可让TNBC肿瘤细胞中的PD-L1和CSN5保持稳定，在卵巢癌细胞中也是如此。在DR5激动剂抗体处理的肿瘤细胞裂解物中并未检测到CSN5上调表达。他们还观察到TNF-α和蛋白酶体抑制剂MG132联合处理可增加肿瘤细胞中PD-L1的基础稳定性。显著的是，长时间蛋白酶体抑制增加肿瘤细胞裂解物中的总PD-L1水平，然而DR5激动剂抗体和MG132联合处理并没有进一步增加细胞表面上的PD‐L1和肿瘤细胞裂解物中总PD‐L1的稳定性。这些结果表明蛋白酶体抑制（通过MG132）潜在地是DR5激动剂信号通路的下游事件。

异质性肿瘤由DR5敏感性肿瘤细胞（A）、DR5部分敏感性肿瘤细胞（B）和DR5潜在抵抗性肿瘤细胞（C）组成。在敏感性肿瘤细胞中，DR5激动剂引发的细胞死亡超过肿瘤清除阈值。它会激活caspase-8和caspase-3，使蛋白酶体功能失活并稳定化细胞内PD-L1。激活的ROCK1潜在地帮助通过某种未知机制将PD-L1动员到膜上。凋亡细胞来源的细胞外囊泡（apoptotic cell‐derived extracellular vesicle，ApoEV）也会释放PD-L1。这些含PD-L1的ApoEV穿梭并将货物PD-L1转移到肿瘤中其他的DR5潜在抵抗性细胞，以增加肿瘤中PD-L1的整体基础库。与此同时，由于外在的DR5激动剂介导的细胞毒性，肿瘤细胞被消除，从而产生部分肿瘤消退和降解。但是，由于PD-L1的过度活跃，浸润肿瘤中的包括T细胞在内的免疫效应细胞被耗尽，从而限制了它们的抗肿瘤反应。共同靶向ROCK1-DR5可降低肿瘤中ApoEV稳定化的PD-L1库，而抗PD-L1-DR5共同靶向可降低肿瘤中基础PD-L1和ApoEV稳定化的PD-L1的免疫抑制功能。

PD-L1稳定化与CSN5无关，但依赖于蛋白酶。图片来自EMBO Molecular Medicine, 2021, doi:10.15252/emmm.202012716。

为此，这些作者利用CRISPR-Cas-9方法生成DR5基因敲除（DR5-KO）TNBC肿瘤细胞。所产生的DR5-KO肿瘤细胞对DR5激动剂不敏感，也没有动员肿瘤细胞表面上的PD-L1。必须指出的是，与DR5野生型肿瘤细胞相比，TNF-α介导的PD-L1稳定化在DR5-KO肿瘤细胞中保持不变。在DR5激动剂处理后，蛋白酶体的调节亚基S5a/PSMD4仅在DR5野生型肿瘤细胞中降解，但在DR5-KO肿瘤细胞（或DR5抵抗性肿瘤细胞）中没有降解。此外，TNF-α信号稳定化PD-L1而不影响S5a水平。考虑到DR5激动剂降解S5a代表了对蛋白酶体功能的干扰，在DR5激动剂抗体Lexa或KMTR2处理后，整体泛素信号仅在DR5敏感性肿瘤细胞裂解物中增加，而在DR5-KO肿瘤细胞中没有增加。总的来说，这些结果证实了PD-L1稳定化的两种不同的蛋白酶体干扰机制，其中的一种通过让PD-L1去泛素化起作用，而另一种通过降解蛋白酶体亚基起作用。 进一步的实验表明位于DR5激动剂信号通路下游的ROCK1在协助动员肿瘤细胞表面上内部稳定化的PD-L1（可能通过CMTM6或其他未知机制）方面起着重要作用。

为了在体内异质性混合肿瘤移植条件下研究用于临床测试的人DR5激动剂，这些作者将人DR5细胞外结构域（ECD）与小鼠DR5的跨膜结构域（TM）和细胞内结构域（ICD）融合在一起。由此形成的DR5构建体通过慢病毒感染在小鼠4T1、MC38和ID8肿瘤细胞中表达，并将表达DR5构建体的细胞移植到小鼠体内。通过开展小鼠存活研究，他们发现相比于仅靶向DR5或PD-L1，共同靶向DR5- PD-L1、DR5-ROCK1或者DR5-PD-L1-ROCK1显著增加它们的存活。进一步的实验表明这种功能靶向导致肿瘤中的CD8+CD45+T细胞和CD4+CD45+T细胞显著富集。相比于仅接受DR5激动剂抗体处理，同时接受DR5激动剂抗体和PD-L1抑制剂处理让肿瘤具有较高的CD8+/CD4+比例，具有较高的颗粒酶B活性（细胞毒性T细胞功能的一种标志），与此同时，这两种联合处理并不增加肿瘤中调节性T细胞的活性。这表明这种联合处理可增加DR5激动剂抗体的抗肿瘤免疫功能和肿瘤杀灭能力。

接下来，这些作者通过基因改造将PD-L1抑制剂avelumab和小鼠DR5激动剂抗体MD5-1整合到一种称为avelu-MD5-1的双特异性抗体中，这种双特异性抗体不仅阻断PD-L1的免疫抑制功能，同时还能够增强DR5-DISC簇集。当在TNBC同源肿瘤模型中进行测试时，avelu-MD5-1导致肿瘤完全消退，相比之下，仅使用类似剂量的avelumab或MD5-1只能让肿瘤保持稳定。

综上所述，这些作者发现了DR5激动剂抗体激活PD-L1的意外发现。他们还发现DR5激动剂抗体激活的caspase-8和ROCK1信号通路调节PD-L1的稳定化和肿瘤细胞表面动员。此外， ApoEV有助于将稳定化的PD-L1库从DR5敏感性的肿瘤细胞转移到混合异质性肿瘤中的DR5抵抗性肿瘤细胞，从而强化免疫抑制肿瘤微环境。联合靶向DR5-ROCK1或DR5-PD-L1可以提高DR5激动剂抗体的抗肿瘤功能。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Tanmoy Mondal et al. Unexpected PD‐L1 immune evasion mechanism in TNBC, ovarian, and other solid tumors by DR5 agonist antibodies. EMBO Molecular Medicine, 2021, doi:10.15252/emmm.202012716.