外泌体在乳腺癌中的研究进展

乳腺癌严重危害着女性的生命和健康，是全球妇女中最常见的恶性肿瘤之一。部分女性死于这种疾病，主要原因为肿瘤的早期转移、药物耐药、肿瘤复发等。因此，乳腺癌的早期诊断对改善患者无复发生存率和提高无病生存率至关重要。全数字化X线乳腺钼靶、超声、磁共振成像等影像学检查广泛应用于乳腺癌的筛查，但其因肿瘤的最小可检出尺寸和部分患者的低辐射而应用受限。血清肿瘤标志物、分子生物标志物由于特异性差和低敏感性，不能及时筛选出早期乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞。而液体活检所提取的外泌体因低成本和无创的取样方法在早期检测、筛选和研究肿瘤动态及复发风险中被广泛应用。外泌体由所有活细胞分泌，是一种直径为30～150nm的细胞外囊泡。外泌体包含其起源细胞的遗传信息，一旦释放，在循环系统中均匀稳定的存在，这种独特的性质使外泌体成为乳腺癌早期诊断、预后监测的一类最有意义的新型标志。其携带的生物活性分子包括促凋亡蛋白-2B、miR-221/222等。现就外泌体在乳腺癌诊断、转移、治疗、耐药中的研究进展予以综述。

01外泌体概述

1.1外泌体的生物发生

晚期内体膜向内出芽，产生被膜覆盖的称为多泡体的小泡。多泡体的直径为250～1000nm，内含几个直径为30～100nm的腔内小泡。腔内小泡由多泡体的内体膜形成，其通过在膜上分离内容物然后向内内陷，并将含有一部分胞质溶胶的膜囊泡释放到多泡体的腔内空间。在内体成熟期间形成的这些多泡体中的一些被引导至溶酶体途径以进行降解，而部分多泡体与质膜融合导致腔内小泡的释放。释放到细胞外环境中的腔内小泡被称为外泌体。外泌体广泛存在于生理或病理液体中，包括血浆、滑膜液、唾液、痰液、脑脊液、淋巴液和腹水。

1.2外泌体的生物功能

根据外泌体的形成和分泌机制，外泌体的形态是不均匀的，其携带大量的生物活性分子，这些分子通常反映了外泌体起源细胞的内容。而外泌体携带的大量生物活性分子(miRNA、蛋白质)水平代表了其起源细胞的表型，外泌体被细胞的磷脂双分子层所包围，其包含了几乎所有的分子，包括蛋白质、核酸和脂质。外泌体通过将特定的分子转移到受体细胞而发挥一系列的生物学作用。其生物学功能包括抗原的表达、参与免疫调节、免疫监视的逃避、逃避细胞凋亡、耐药等。外泌体是肿瘤微环境的组成部分，其通过与受体细胞细胞膜的直接融合，或受体细胞吞噬外泌体后再与细胞膜的间接融合，或与受体细胞表面的特异性受体结合后释放其携带的内容物，导致受体细胞的遗传信息交换和代谢重组，并在肿瘤微环境中介导细胞间通信，参与组织浸润、转移和血管生成，最终导致肿瘤微环境恶化，进而促进受体细胞的增殖、侵袭和转移，并转移耐药性，从而促进肿瘤复发及转移。

02外泌体miRNA、蛋白质在乳腺癌诊断中的作用

外泌体及其内容物作为细胞间信息交流的重要载体，参与肿瘤增殖、播散、浸润等过程的调控，可作为癌症诊断或预后的标志物。外泌体miRNA是诊断乳腺癌的生物标志物，Hannafon等发现miR-21和miR-1246水平在乳腺癌患者中明显升高。他们的结果支持了外泌体miRNA可作为乳腺癌重要诊断工具的观点。此外，基质金属蛋白酶10、热激蛋白90、膜联蛋白-1在乳腺癌患者血清或胸腔积液的外泌体中特异性表达。Moon等证明，血浆中检测到的含有发育内皮基因座-1和纤维连接蛋白的外泌体可作为早期诊断乳腺癌的生物标志物，且发育内皮基因座-1是一个可以用来区分乳腺癌与乳腺良性肿瘤和非癌性疾病的有用标志物。

03外泌体参与乳腺癌的侵袭和转移

侵袭和转移是恶性肿瘤的特征。侵袭和转移是一个复杂、多步骤的过程，而每个步骤都涉及肿瘤细胞与围绕肿瘤的正常细胞之间的“串扰”，这些囊泡在细胞之间转移信使RNA、miRNA和蛋白质等分子，诱导相应的信号通路活化从而影响组织侵袭、转移。

3.1 外泌体形成及内容物的异常

外泌体在形成、分泌内容物的过程中出错会促进乳腺癌的转移。研究发现，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶表达减少或该酶的药理学抑制使编码溶酶体液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)质子泵(ATP6V1A)A亚基的mRNA不稳定，导致其表达减少。ATP6V1A水平的降低削弱了溶酶体降解活性并导致多泡体增大，然后多泡体与质膜融合并释放含有不同载体的外泌体，并强烈促进细胞存活和迁移。该研究进一步证明了在减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶表达后，组织蛋白酶的分泌显着增加，其降解细胞外基质，允许肿瘤细胞侵入周围组织，促进乳腺癌的转移。同时，外泌体内组分miRNA和蛋白质也参与乳腺癌的转移。Zhou等发现，外泌体介导了miR-105的转移，因miR-105减少了紧密连接蛋白的表达，破坏细胞与细胞的紧密连接，导致天然屏障被破坏，从而诱导细胞转移。Maji等发现，乳腺癌细胞来源的外泌体中的膜联蛋白A2是作为乳腺癌细胞脑和肺特异性转移的介质，其通过引起巨噬细胞介导的p38促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB和信号转导及转录激活因子3通路活化，促进白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的分泌。

3.2介导免疫抑制

在免疫系统方面，外泌体可以介导免疫抑制，从而促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤细胞释放的外泌体可通过抑制树突状细胞分化和成熟障碍，降低自然杀伤细胞的细胞毒性，诱导巨噬细胞极化，抑制细胞毒性T淋巴细胞反应的损伤和诱导调节性T细胞［分泌免疫抑制细胞因子(白细胞介素-10、转化生长因子-β1)］的产生以及调控B细胞的活化来帮助癌细胞逃避免疫攻击。Piao等证实，乳腺癌细胞来源的外泌体的增殖可通过刺激巨噬细胞极化为淋巴结的转移创造有利条件。Okoye等发现，调节性T细胞可以通过外泌体传递miRNA来抑制效应T细胞，调节性T细胞来源的外泌体含有成熟和未成熟的miRNA，尤其是具有促凋亡或抗增殖功能的miRNA，这些miRNA可以抑制环氧合酶基因，从而限制辅助性T细胞1相关反应。

3.3 改变肿瘤微环境

肿瘤微环境常被比作肿瘤细胞生长的土壤。其是指围绕肿瘤细胞的各种正常细胞、信号分子、血管和细胞外基质。外泌体由原发肿瘤分泌并通过循环传递，其可诱导远处器官转移前生态位的形成，为肿瘤细胞提供营养物质，同时外泌体能促进原发肿瘤的生存和生长。研究发现，乳腺癌细胞外泌体中的蛋白质可以促进器官特异性转移和血管生成。脂肪细胞作为肿瘤微环境中的一部分参与乳腺癌的转移。另有研究发现，间充质干细胞分化的脂肪细胞外泌体通过激活Hippo信号通路，影响肿瘤发展的相关基因，进而促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。氧气对于细胞的生理活动十分重要。文献报道，暴露于低氧环境下的癌细胞增加了外泌体的产生，这些外泌体通过与受体细胞接触来刺激癌细胞的侵袭和转移。

04外泌体在乳腺癌治疗中的应用

4.1作为纳米载体用于乳腺癌的治疗

乳腺癌化疗及内分泌药物治疗对健康组织的不良反应，使乳腺癌的治疗更加困难。外泌体具有较高的血清稳定性、毒性低、易通过各种屏障、较高的生物相容性和较低的免疫原性，基于以上特性，外泌体具有作为纳米载体传递药物的潜力，可用于乳腺癌的治疗。多柔比星的心脏毒性使乳腺癌患者的化疗药物剂量受到限制。Hadla等证明，与游离药物相比，多柔比星包裹的外泌体降低了心脏毒性和减少了对其他组织的不良反应，因此多柔比星的剂量可以增加，从而靶向增加了对乳腺癌细胞的细胞毒性作用。乳腺癌转移到局部淋巴结和远处器官是乳腺癌高死亡率的主要原因。一项研究发现，用巨噬细胞来源的外泌体组成的纳米平台在受到生物激发后，可以优先在原位和肺转移的肿瘤细胞聚集，快速内化到肿瘤细胞中，分解并释放其活性药物核心，从而触发凋亡信号，抑制细胞增殖，其可用于乳腺癌肺转移的患者。

4.2 减少外泌体的释放治疗乳腺癌

越来越多的药物通过抑制外泌体的分泌而用于乳腺癌的治疗。如口服抗菌药物磺胺异口恶唑是一种特异性的抑制乳腺癌细胞产生和分泌外泌体的抑制剂，其通过靶向内皮素受体A而抑制乳腺癌的生长和转移，且无明显毒性。卤夫酮通过抑制乳腺癌细胞外泌体的释放，减少miR-31的释放，进而下调组蛋白去乙酰化酶2基因，组蛋白去乙酰化酶2通过调节G1/S细胞周期组分(p21、细胞周期蛋白依赖性激酶2和细胞周期蛋白D1)，调节细胞周期循环，从而抑制乳腺癌细胞增殖。紫草素是从紫草中分离得到的一种萘醌类化合物，它通过减少肿瘤来源的外泌体释放，抑制乳腺癌细胞的增殖。

4.3 参与乳腺癌的免疫治疗

肿瘤对免疫系统的逃逸，使肿瘤的治疗更加困难，因此使用基于外泌体激活免疫应答成为一种新的癌症治疗策略。Wang等用腺病毒载体转染树突状细胞的外泌体制成疫苗，该疫苗刺激了细胞毒性T淋巴细胞的反应，并观察到可杀死癌细胞和根除肿瘤。Cheng等设计了一种新外泌体，即合成多价抗体重定向外泌体，该外泌体可以同时靶向T细胞表面CD3和肿瘤细胞表皮生长因子受体，可诱导表皮生长因子受体阳性细胞在非活化状态下被外周血单个核细胞高效、特异性杀伤，进而发挥良好的抗肿瘤作用。有研究发现，肿瘤源性外泌体携带肿瘤抗原，其可触发抗原呈递细胞的高效抗原呈递，可作为肿瘤抗原的来源制备肿瘤疫苗激活免疫系统，进而促进抗肿瘤反应。

05外泌体参与乳腺癌的耐药

目前，乳腺癌术后化疗及内分泌药物在其治疗中占重要地位，但仍有部分患者出现耐药，阻碍其治疗。外泌体通过参与耐药机制的形成、改变肿瘤微环境、转移内容物等参与乳腺癌的耐药。

5.1 耐药机制形成

P-糖蛋白存在于外泌体中，其通过泵出药物维持细胞水平超过有效浓度而导致耐药。有文献报道，外泌体介导的细胞-细胞转移P-糖蛋白是外泌体促进乳腺癌细胞耐多西紫杉醇的主要机制。瞬时受体电位通道5可以刺激P-糖蛋白的形成，若瞬时受体电位通道5在外泌体中聚集，则可以增加外泌体捕获P-糖蛋白，从而使乳腺癌细胞对阿霉素耐药。Matula等研究显示，上调瞬时受体电位通道5在受体细胞中的表达，可通过激活T细胞亚型c3介导的钙离子和转录因子核因子来增加药物外排P-糖蛋白的量，从而导致乳腺癌细胞耐药。Chen等的研究表明，乳腺癌细胞分泌的外泌体miR-451可与多耐药基因1结合，下调P-糖蛋白的表达，进而导致乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性降低，治疗效果较差。

5.2 改变肿瘤微环境

肿瘤微环境参与乳腺癌的耐药。肿瘤相关成纤维细胞通过旁分泌外泌体增强肿瘤干细胞的自我更新能力，并上调肿瘤干细胞中ABCB5(ABC转运蛋白家族中的一员，与乳腺癌的化疗耐药有关)的表达促进其对化疗药物的抵抗，进而诱导乳腺癌化疗耐药。Boelens等发现，Rab27b蛋白的上调导致基质细胞外泌体的过度释放，这些外泌体诱导邻近乳腺癌细胞中的信号转导及转录激活因子1蛋白并激活Notch3信号通路，导致乳腺癌细胞化疗耐药和对放疗的敏感性降低。Yang等证明了阿霉素耐药的乳腺癌细胞分泌携带泛素羧基末端水解酶-1和P-糖蛋白的外泌体进入细胞外微环境，然后以时间依赖的方式整合到对阿霉素敏感的乳腺癌细胞中，从而转移耐药性。

5.3 转移miRNA

外泌体通过将特定的miRNA转移到敏感的受体细胞中，从而发挥耐药作用。外泌体在结合、吸收和内化后，可通过调节基因表达、信号通路、细胞周期分布和药物诱导的凋亡来改变受体敏感细胞的易感性。其中，miR-221/222参与三苯氧胺耐药，受体细胞中miR-221/222水平的升高减少了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27和雌激素受体α的靶基因表达，导致细胞周期失调和他莫昔芬耐药。miR-222、miR-100和miR-30a参与阿霉素的耐药，受体细胞中上述miRNA水平的升高，导致乳腺癌细胞转录水平的改变和阿霉素耐药。靶基因预测和通路分析研究结果显示，在治疗失败的通路中，多西他赛耐药乳腺癌细胞的外泌体中含有20个丰富的miRNA，这些含有miRNA的外泌体能够下调敏感细胞中的miR-23a、miR-222和miR-452，参与多西他赛的耐药。

外泌体及其内容物可用于乳腺癌的早期诊断，且特异性和敏感性优于传统的生物标志物，其各种作用也被广泛研究。一方面，外泌体在乳腺癌细胞中有抑制增殖和提高化疗反应的作用，经过处理的的外泌体特异性靶向乳腺癌细胞，提高化疗效果及延长药物的半衰期。另一方面，乳腺癌细胞外泌体在正常乳腺细胞中诱导致癌特性，在化疗敏感的乳腺癌细胞中诱导对化疗和放疗的耐药，且乳腺癌细胞外泌体也参与乳腺癌的侵袭和转移，其通过激活相应的信号通路，导致非侵袭性乳腺癌细胞的迁移和转移。然而，外泌体的这些作用机制尚未得到证实。虽然许多候选的外泌体生物标志物被建议用于乳腺癌诊断，但因其分离提取纯化的方法较难导致其停留于实验阶段。未来，外泌体由于低免疫原性可作为纳米载体的特性，将成为免疫治疗、基因治疗乳腺癌的新方向。(生物谷Bioon.com）

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