利用CRISPR/HDR技术进行工程化改造有望赋予杂交瘤抗体多样化的功能！

2019年9月30日 讯 /生物谷BIOON/ --如今，生物工程师和生命科学家能够结合杂交瘤技术来制造大量相同的抗体，同时还能开发出新型的抗体疗法和诊断技术，近年来该技术的临床前和临床研究都突出了抗体型别对于治疗效果的重要性。在一项最新研究中，来自荷兰的研究人员开发出了一种多用途的CRISPR和同源定向修复（HDR）平台，其能够快速设计免疫球蛋白结构域并形成重组杂交瘤，其能够分泌设计抗体的首选格式、物种或亚型。研究人员认为，这种通用型的平台或将能够促进大规模抗体工程研究，助力科学家们进行临床前的抗体研究工作。

图片来源：Science Advances,doi:10.1126/sciadv.aaw1822

单克隆抗体（mAb）的应用彻底改变了医学领域，其能用来治疗曾经科学家认为无法治愈的多种疾病。从1975年开始，杂交瘤技术被广泛应用于单克隆抗体的发现、筛选和生产，在过去10年里，科学家们为临床研究制造了大量杂交瘤，并对其进行了验证和发展，其中mAb的形式和型别对于理解其在临床前模型中的表现非常重要。基因工程所产生的mAbs通常采用重组技术进行生产，其中的可变结构域能进行测序、并且克隆到质粒中，在瞬态系统中进行表达；但这些过程比较耗时、具有挑战性且成本高昂，会严重阻碍临床前的研究进程。

当前研究中，研究人员使用一步式的CRISPR/同源性定向修复技术对杂交瘤进行了工程化修饰，随后其迅速产生了重组杂交瘤，分泌Fc格式的单克隆抗体，且能够自由插入首选标签或插入突变。研究人员制造出了能产生片段抗原结合（Fab）的杂交瘤，即通常与抗原结合的抗体位点，其C端带有位点特异性化学酶修饰和纯化的标记，研究者所制造出的杂交瘤能够分泌同型和既定种类的嵌合抗体，同时还能产生并不损害抗原特异性的Fc突变抗体。

随后研究人员从杂交瘤上清液中分离出了工程化的抗体，从而就能够在体内和体外来观察其预期的生化和免疫学特征，由于研究者的目标是靶向作用免疫球蛋白基因座的恒定结构域，因此CRISPR/HDR的方法能够适用于任何物种或同种型的杂交瘤。此前研究人员利用Fab片段来治疗特定的自身免疫性疾病，靶向作用不同的治疗性纳米药物并产生双特异性抗体，在获得Fab片段的常规技术中，科学家们无法为基因组安装有用的标签或突变，为了在当前工作中使用CRISPR/HDR来获得Fab分泌型杂交瘤，研究人员选择杂交瘤克隆NLDC-145来作为第一个靶点，其能够分泌特定的mAbs的，为了靶向作用克隆的重链基因座，研究者利用优化的引导RNA来指导Cas9蛋白质目标铰链区并产生双链断裂。为了修复双链断裂，研究人员设计出了一种HDR结构并插入了感兴趣的靶点，由于HDR的功率通常较低，因此研究人员丰富了含有含有供体构建物的细胞的能力，随后他们使用PCR技术鉴定了供体构建体的插入，从而确定了供体构建体能够整合到正确的基因组位置。

一周后，研究人员获得了单克隆细胞悬液，并使用上清液来确定分泌产物的抗原特异性和表型，在流式细胞仪的帮助下，研究人员观察到了大部分单克隆杂交瘤进行了成功地基因改造，并通过蛋白印迹分析验证了相应的结果，从而坚定了目标抗体产物或蛋白质。在成功形成充足杂交瘤从而产生Fab片段后，研究人员使用相同的策略开发了免疫肿瘤学中所使用的杂交瘤。在建立并验证杂交瘤CRISPR/HDR基因组工程学手段后，研究人员对同型转换的mAbs的功能或生物学特性进行表征分析，随后他们进行了测定以确定抗体-受体之间的相互作用，根据其观察到的激活和抑制受体的能力，研究者预测了CRISPR工程化mAbs引起的抗体依赖性细胞毒性能力，未来完成表征研究，研究人员在体内和体外测试了抗体在诱导抗体依赖性细胞毒性上的潜力。

图片来源：Science Advances,doi:10.1126/sciadv.aaw1822

在实验室中，研究者利用鼠结肠腺癌细胞（MC38）来促进颗粒的吞噬作用，同时还会表现出MIH Fc突变体与全血之间的相互作用，在体内实验中，研究者测试了MIH Fc突变体剔除B细胞的能力。随后研究者对小鼠实施安乐死，并使用流式细胞仪和免疫荧光成像技术分离了小鼠的脾脏来确定B细胞的耗竭情况，体内和体外实验均得到了相似的结果，研究结果表明，使用CRISPR/HDR设计的嵌合和突变mAbs与天然和重组对应物具有相同的生化和免疫因子特性。

研究人员利用上述方法开发了一种多功能平台，其能从亲本杂交瘤开始轻松快速产生Fc工程抗体，研究者使用一步CRISPR/HDR方法就能够获得杂交瘤，并在21天时间内产生1）单价Fab片段；2）来自外来物种的Fc同型突变体；3）没有效应子功能的Fc沉默突变体。这种方法包括用于纯化和位点特异性缀合的有用蛋白标签，同时该技术还能用于任何实验室进行杂交瘤细胞培养。

最后研究者表示，由于杂交瘤产品主要用于体内临床前研究，因此该方法未来或将有助于临床抗体的研究及帮助开发治疗性抗体，工程抗体产品的位点特异性功能化将会广泛应用于生物医学工程、化学生物学、药物开发和纳米医学等领域。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

【1】Johan M. S. van der Schoot， Felix L. Fennemann， Michael Valente，et al. Functional diversification of hybridoma-produced antibodies by CRISPR/HDR genomic engineering， Science Advances  28 Aug 2019： Vol. 5， no. 8， eaaw1822 DOI： 10.1126/sciadv.aaw1822

【2】Antibodies to watch in 2018

【3】G.KOHLER & C. MILSTEIN. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity， Nature volume 256， pages495–497 (1975) doi：10.1038/256495a0

【4】Martin Jinek， Krzysztof Chylinski， Ines Fonfara， et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity， Science  17 Aug 2012： Vol. 337， Issue 6096， pp. 816-821 DOI：10.1126/science.1225829

【5】Genome engineering with CRISPR/HDR to diversify the functions of hybridoma-produced antibodies

by Thamarasee Jeewandara， Science X Network， Phys.org