外泌体--癌症的“双刃剑”

一、外泌体的历史

20世纪80年代初研究人员在体外培养的正常细胞或者肿瘤细胞发现细胞外泌现象，细胞向其培养基中分泌带有细胞膜特征的囊泡结构。1983年Johnstone等发现体外培养的绵羊网格红细胞在成熟过程中会向外分泌含有铁转运蛋白受体(transferrin receptor)的小囊泡结构，他们将细胞释放的这种小囊泡结构命名为外泌体(图2)。

早期发现分泌外泌体的细胞主要是一些造血类细胞系，如B细胞，T细胞，树状突细胞，肥大细胞，血小板等。随着研究深入，许多非造血类细胞也大量产生外泌体，如肿瘤细胞，表皮细胞及神经细胞等。

供体细胞分泌的外泌体可直接被同组织内其周围的受体细胞吸收；同时外泌体也可进入到体液循环中，如血液，唾液，尿液，脑脊髓液等，通过体液运输被不同组织内受体细胞吸收，实现组织间物质交流(图3)。

二、外泌体形成及功能

外泌体并不能简单理解为细胞直接向外界环境分泌的囊泡结构，其形成过程有着复杂的调控。主要可分为三个阶段，细胞膜内陷形成胞内体，胞内体多囊泡化和多囊泡体与质膜融合释放外泌体。

真核细胞内吞形成初级胞内体(early endosome)，在高尔基体等膜细胞器和胞内体蛋白分选转运装置(ESCRT)等蛋白的调控下成熟，为次级胞内体(late endosome)。次级胞内体自身外膜常内陷形成许多小囊泡结构，使次级胞内体中常含有许多囊泡，故又称为多囊泡体(multivesicular bodies，MVB)。其中一些MVB直接与细胞内溶酶体(lysomsome)融合并降解；一些MVB运往高尔基体进行回收；而还有一些MVB与质膜融合向细胞外释放小囊泡，即外泌体(图4)。细胞分泌外泌体是受细胞精确调控的，其中包括一系列蛋白(ESCRT，Rab等)的参与调节，细胞内(钙离子浓度，氨基酸浓度等)与细胞外(pH等)环境的影响。

外泌体是具有生物活性的囊泡膜结构，内含有脂质体，蛋白质，RNA和miRNA等物质。不仅可以被周围的细胞吸收，也可以进入体液循环中被不同的组织细胞吸收，实现细胞间的物质和信息传递，参与对受体细胞基因表达水平的调控，最终影响受体细胞的生理功能。

外泌体参与许多生物学功能，包括免疫调控，B淋巴细胞释放携抗原呈递蛋白的外泌体可诱导T淋巴细胞免疫应答；导致一些疾病的形成与发展，神经退行性疾病阿兹海默症等；促进病毒感染与传播，如HIV病毒可通过外泌体寻找最适细胞进行感染及传播；此外，在癌症中外泌体也扮演着重要的角色，本文将对外泌体与癌症的关系及其在癌症检测与治疗中的应用进行全面的介绍。

三、外泌体--癌症的发生及恶化中扮演着重要的角色

1981年已发现体外培养的癌细胞有外泌现象，之后在许多癌细胞中都发现外泌体的释放，如卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌等(图5)。不仅如此，癌细胞往往对外释放高于正常细胞的外泌体，卵巢癌患者血液中EpCAM阳性外泌体的含量要显着高于正常人和卵巢良性疾病患者。癌细胞分泌大量外泌体可能是由于某些原癌基因或者抑癌基因的突变易使外泌体生成或分泌增加；同时癌细胞周围低pH微环境也可诱导其大量分泌外泌体。

癌细胞分泌的外泌体在癌症的发生及恶化过程中起着重要作用。外泌体可促进癌细胞的增殖，扩散及帮助癌细胞逃离来自体内自身或者体外的清除机制(图6)：

1、外泌体促进癌细胞的增殖

癌细胞通过分泌外泌体，将细胞内的致癌因子(蛋白，核酸等)转运到受体细胞，可促进受体细胞增殖及癌变。乳腺癌分泌的含有HER2原癌蛋白的外泌体，卵巢癌分泌的含有miR-21外泌体，可激活受体细胞原癌基因，抑制其抑癌基因，促进癌细胞的增殖。

癌细胞可向外释放带有细胞凋亡因子(caspase-3等)的外泌体，降低自身细胞凋亡活性；同时也向外释放含有抑制凋亡的因子(survivin等)的外泌体，进入受体细胞，降低受体细胞凋亡活性，促进癌细胞的增殖。

癌细胞通过分泌携带血管生成因子(Del-1，miR-210等)的外泌体，被癌变组织附近内皮细胞吸收，促进癌变组织内新血管的形成，为肿瘤的生长提供更多的营养。

2、外泌体能够帮助癌细胞逃离免疫系统或者药物的清除

癌细胞分泌的外泌体能够抑制对癌细胞的免疫应答，既可以通过激活骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)抑制T细胞免疫应答，也可以通过破坏肿瘤抗原呈递过程来降低细胞的免疫应答；同时外泌体还能够诱导免疫细胞凋亡，如前列腺癌外泌体中的Fas配体诱导T淋巴细胞凋亡。因此，外泌体能够降低免疫系统活性，帮助癌细胞逃离免疫清除。

此外，有研究发现在药物治疗癌症过程中，癌细胞可分泌外泌体将药物从细胞内转运到细胞外，以减少药物对细胞的毒性(黑色素瘤cisplatin治疗过程)；同时也发现获得抗药性的癌细胞可分泌携带有抗药因子的外泌体，被其它癌细胞吸收后，可产生抗药性。因此，外泌体又能够帮助癌细胞逃离药物的清除。

3、外泌体常为癌细胞的扩散创造有利的微环境

我们可以用“种子与土壤”来做个类比，癌细胞为“种子”，癌细胞生长的微环境为“土壤”。癌细胞分泌的外泌体不仅在组织内部为癌症的生长创造合适的微环境，还可以通过体液进入不同的组织，建立有利于癌细胞生长的微环境，为癌细胞的扩散形成有利条件。最为常见的是癌细胞向淋巴结扩散时，会向淋巴结中分泌大量外泌体，为癌细胞在淋巴结的生长创造合适的微环境。

外泌体如同癌症的一把“利剑”，能够促进癌细胞不断增殖，帮助癌细胞逃离免疫或药物的清除，为癌症的扩散创造合适的微环境，在癌症的发生及恶化过程中扮演着重要的角色。

但是，这是一把“双刃剑”，在利于癌症发生的同时，暴露了癌症的存在，成为癌症诊断的有效手段；外泌体与癌症的密切联系，也为有效治疗癌症提供了新的策略。

四、外泌体--癌症诊断中的应用

如我们所知，外泌体是细胞向外分泌的小囊泡，因此，外泌体具有供体细胞的物质组成特征，具有一定的细胞特异性。在对癌症患者体内外泌体的大量研究中发现，癌细胞分泌的外泌体中有可用于区别其它细胞外泌体的特征性分子，可以作为癌症诊断的分子标志物。目前，常见的可应用于癌症诊断的外泌体中分子检测标志物主要包括两类：蛋白质和核酸。

1、外泌体蛋白质标志物可用于癌症诊断

基于大量研究结果表明，癌症患者体内的外泌体中一般会富集两类蛋白质分子，一类是在癌细胞中高表达的蛋白质，如原癌蛋白；一类是被癌细胞特异地向外外分泌的蛋白质，如抑癌蛋白。异于正常外泌体的特点，使外泌体中的这些蛋白质分子可以作为癌症诊断的标志物。目前许多外泌体蛋白质标志物被发现可用于癌症的诊断，包括癌症的早期诊断，预后复发风险评估(表1)。

外泌体蛋白质标志物可用于癌症的早期诊断。癌症发现的越早，治愈的机率越大，预后5年生存率更高。外泌体蛋白质标志物检测可应用于许多癌症的早期诊断，如Fibronectin，EDIL3用于乳腺癌早期诊断；卵巢癌早期诊断标志物Claudin-4；Survivin可用于前列腺癌的早期诊断(图7)。

外泌体蛋白质标志物检测也可作为很好的预后复发风险评估手段。胰腺癌中发现外泌体蛋白Glypican-1既可以用于癌症早期诊断，也是很好的预后检测手段；非小细胞肺癌患者中的外泌体蛋白NY-ESO-1标志物可用于评估患者预后5年生存率。

外泌体蛋白质标志物检测提高了癌症诊断的精准性。前列腺癌诊断中，外泌体Survivin蛋白标志物检测比传统血液PSA蛋白检测更精确；卵巢癌诊断中，外泌体蛋白标志物Claudin-4比传统的CA125蛋白检测准确度更高。

外泌体多蛋白标志物结合使用，可显着提高癌症诊断的精准性。Sorensen等在肺癌检测中利用外泌体中多蛋白标志物(CD151，CD171，TSPAN8)，发现可获得更为准确的癌症诊断结果。

2、外泌体核酸标志物可用于癌症诊断

外泌体中蛋白质的存在伴随着外泌体的发现即被验证，像铁转运蛋白等(图2)。但直到20多年后Valadi等于2007年在小鼠和人的肥大细胞外泌体中首次发现RNA和miRNA的存在，并具有生物活性，可以被受体细胞吸收，影响受体细胞的表达。1年后Taylor等发现外泌体miRNA可用于癌症诊断标志物。他们从卵巢癌患者与未患癌的血清中分离获得的EpCAM阳性外泌体，通过分析外泌体中miRNA含量差异，发现8个miRNA可作为卵巢癌各时期诊断标志物，开启了核酸标志物在癌症诊断的应用(图8)。

之后大量外泌体miRNA被发现，可作为癌症诊断检测的标志物。结直肠癌外泌体中的7个miRNA可作为各时期结直肠癌的诊断标志物；外泌体中的miR-21，miR-1246可作为乳腺癌检测的标志物。除此以外，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌等癌症中，都发现可以作为癌症诊断的外泌体miRNA标志物(表2)。

外泌体miRNA标志物检测可作为癌症预后复发风险评估手段。外泌体miR-19a可作为结直肠癌低治愈率评估，研究发现外泌体中miR-19a含量高的结直肠癌患者易发生肝转移，预后复发率高，5年生存率低。而miR-4772-3p能作为结直肠癌2期和3期在FOLFOX化疗后的复发评估标志物，外泌体中miR-4772-3p含量低的结直肠癌患者，在FOLFOX化疗后复发率高，生存率低。

除了miRNA类标志物，外泌体中其他的核酸分子也发现可作为癌症诊断的标志物。Manterola等发现来源于血清的外泌体中小的非编码RNA分子RNU6-1可应用于诊断多形性成胶质细胞瘤；Nilsson等发现来源于尿液的外泌体中的PCA-3，TMPRSS2：ERG转录RNA分子是潜在的前列腺癌诊断标志物；Melo等发现GPC阳性外泌体中带有KRAS突变的DNA分子可用于胰腺癌的诊断及个性化治疗。

3、外泌体“液态活检”在癌症诊断中的应用

细胞分泌的外泌体可直接从各种体液中，血液，尿液，唾液，腹水，胸腔积水等中获取，且癌症患者体液中往往含有大量的外泌体，为外泌体液态活检应用于癌症诊断提供了物质基础；大量研究结果表明多种癌症可利用外泌体中的蛋白质或核酸标志物进行诊断，如乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，结直肠癌等，为外泌体液态活检应用于癌症诊断提供了理论基础；外泌体可以直接从各种体液中大量的纯化获得，纯化及鉴定技术日趋完善，为外泌体液态活检应用于癌症诊断提供了技术基础(附3)。

外泌体液态活检应用于癌症诊断的优势可总结为三点：样本易取，稳定性好，覆盖癌症异质性。

外泌体液态活检相较于组织活检，无创取样，取样便捷。伴随着外泌体纯化及鉴定技术的提升，使得其易从血液和尿液中大量获得，对样本的需求量也变小(附3)。

外泌体液态活检稳定性优势主要体现在两方面：一方面是外泌体能够维持内部分子标志物稳定性。外泌体可以很好的保护内部核酸或蛋白质不被体液中的各种酶降解，Valadi等发现外泌体内RNA分子不会被外部环境的RNase降解。另一方面外泌体在长时间的体外储存样本中依然稳定存在，活性维持的很好。Taylor等发现4度存放24hr的血液样本中的外泌体miRNA标志物仍然可用于卵巢癌检测。从-80度储存两年样本中获取的外泌体，依然有着较好的稳定性。

外泌体液态活检相比于传统的组织活检，覆盖了癌症的异质性，反映癌症的全貌。癌症异质性是癌症发生及转移的基础，也是癌症诊断和治疗的障碍。传统组织活检受限于取样，不能完全覆盖癌症的异质性，尤其对癌症晚期或转移的患者，而外泌体液态活检可很好的覆盖癌症的异质性。同时在癌症治疗过程中，外泌体分子标志物可随着治疗发生变化，因此，外泌体液态活检又可以对病人进行动态监控。

从癌症患者体液中大量获取的外泌体，通过蛋白质或核酸标志物检测，可用于癌症诊断及预后复发评估，显着提高了液态活检在癌症诊断中的应用(图9)。目前外泌体液态活检已经逐步开始应用于癌症的诊断中，如2016年Exosome Diagnostics公司推出ExoDx Lung(ALK)检测产品，有效地应用于非小细胞癌诊断中，未来将会有越来越多的外泌体液态活检产品应用于各种癌症的诊断中。

五、外泌体--癌症治疗中的应用

外泌体不仅可以为癌症诊断提供分子检测标志物，还可用于癌症治疗中。目前外泌体癌症应用中研究较多的是作为癌症治疗的工具，当然也发现外泌体可直接作为癌症治疗的靶向(图10)。

1、外泌体可作为癌症治疗的工具

外泌体作为癌症免疫治疗的工具。目前较为成熟的研究是从癌症患者中分离树状突细胞的外泌体(DEX)，然后进行体外抗原多肽(MAGE)的引入，再将改造的外泌体重新导入患者体内，可激活体内的免疫系统，从而促进对癌症细胞的免疫清除。该技术初步应用于一些癌症患者的治疗，如黑素瘤，非小细胞肺癌等。

外泌体可作为癌症治疗药物的载体，可承载各种类型的药物，包括核酸，蛋白质，脂类物质或其它小分子化学物。外泌体可通过血液等体液运输与传递，被癌细胞吸收，实现药物对癌症的靶向治疗；外泌体是细胞自身分泌物，相比于目前常用的脂质体和聚合纳米微颗粒，不易引起免疫排斥反应，毒副性小，稳定性好；外泌体能够维持内部药物稳定性，尤其是对核酸或蛋白类药物；外泌体可以提高疏水类药物的溶解性，增加药物在体液中的含量，提高药物被癌变组织吸收的效率。此外，外泌体作为药物载体，能够促进不易被体液药物直接靶向的组织有效地吸收药物，比如脑，外泌体可提高药物从血液向脑组织内的吸收，有效地治疗脑部的癌变。

2、外泌体可能作为癌症治疗的直接靶点

大量研究发现，外泌体直接参与癌症的发生与恶化，其中包括携带致癌因子(原癌蛋白，RNA等)导致受体细胞癌变，癌细胞的转移与扩散；同时外泌体可抑制免疫细胞的活性(免疫细胞凋亡等)，使得癌细胞可以逃离免疫系统清除。

因此，Aethlon Medical研发了一套装置Hemopurifier？，可特异性地清除癌细胞来源的外泌体，解除其对免疫系统的抑制，从而实现对癌症的治疗。而有些研究直接将外泌体作为药物的靶向，比如抑制外泌体的合成与分泌，如amiloride；阻碍外泌体被受体细胞吸收，如diannexin。但是目前发现的靶向外泌体治疗存在获益患者少，毒副作用不太清楚等问题，仍然需要更多地研究。

总之，外泌体作为癌症的治疗策略现在仍在研究中，需要克服的一些应用中的问题：如高纯度的外泌体获取依然存在技术局限与成本高的问题；外泌体治疗过程中是否会有副作用也无法完全确定；能否体外合成外泌体用于癌症治疗仍需更多对外泌体结构的全面认识。当然，外泌体作为癌症的治疗工具已经有了初步的临床医学进展，在未来外泌体的应用可能成为治疗癌症的有效手段。

六、小结

外泌体像一把“双刃剑”，与癌症有着密切的联系。外泌体既可以促进癌细胞的不断增殖与扩散，对癌症的发生及恶化有着重要的作用；而同时外泌体又可以应用于癌症的诊断与治疗，外泌体液态活检提高了癌症诊断的便利性，精确性，外泌体实现细胞间物质运输的特征被应用于癌症的治疗中。当然，目前外泌体在癌症诊断与治疗中的应用尚处于初级阶段，未来仍需要对外泌体有更深入的认识，使其能更好地应用于医疗，提高癌症患者的生存率。

外泌体(exosomes)与微囊泡(microvesicles)都是细胞向外分泌的囊泡状膜结构，但是在结构组成和生物学功能上两者还是不同的。主要区别可以总结为三点：

一是大小和形状不同；外泌体较小，30-120nm左右，大小形态均一；而微囊泡一般较大，50-100

二是产生机制不同；外泌体的产生需要细胞膜内陷，与胞内体融合，形成MVB，然后在与质膜融合释放。而微囊泡一般指直接是细胞外排囊泡结构。同样都有质膜特点，但是外泌体膜还具有胞内体膜特征；

三是膜包裹物质不同；由于产生机制的区别，所以外泌体内物质与胞内体有关，而微囊泡一般不具备。

但是，外泌体与微囊泡在许多研究中，并没有作很好的区分，甚至不作区分(称为胞外囊泡Extracellular vesicles EV)；一是受限于纯化技术，很难彻底地将外泌体与小的微囊泡(低于100nm)分开；二是缺乏统一的标准，即使针对外泌体的大小范围，不同的研究人选取的标准也不尽相同。故上述仅为现在普遍接受的一个区分标准，随着研究的深入与技术的革新，今后可能会对细胞各种囊泡结构有了更为精确地认识。(生物谷Bioon.com）

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