Genome Medicine：发现肺炎克雷伯菌毒力质粒的非自主转移

近日，生物学知名刊物《Genome Medicine》发表了上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室和上海交通大学医学院附属瑞金医院的合作论文，报道了肺炎克雷伯菌非接合型毒力质粒在接合质粒辅助下的非自主转移。瑞金医院博士生徐燕萍和生命科学技术学院博士生张剑峰为论文共同第一作者，瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授、生命科学技术学院欧竑宇教授和瑞金医院临床微生物科孙景勇副主任技师为论文的共同通讯作者。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种肠杆菌科条件致病菌，是我国临床分离最常见的革兰阴性耐药菌之一。肺炎克雷伯菌通常被分为经典肺炎克雷伯菌（cKP）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）两种菌型。cKP常携带耐药质粒，如IncF接合质粒编码碳青霉烯酶KPC。hvKP常携带编码粘液调节子和铁载体等重要毒力因子的非接合型质粒。近年来，出现了多重耐药合并高毒力的肺炎克雷伯菌临床株，对抗感染治疗产生巨大的挑战。这类高毒力高耐药菌株可能通过两种途径演化而来：(i) 高毒株hvKP从cKP获得了可自主转移的耐药质粒；(ii) 耐药株cKP从hvKP中获得了可转移的毒力质粒。但目前缺乏毒力质粒在cKP和hvKP间转移等关键的遗传学实验证据。近期有文献报道，在cKP临床菌株中发现了毒力质粒与耐药质粒形成的杂合质粒，可接合转移；以及耐药质粒和毒力质粒共存于一株cKP中，毒力质粒可单独转移，或通过和接合型耐药质粒融合后共同转移。然而，临床上常见的hvKP分离株仅含一个pLVPK样的毒力质粒；这种典型的毒力质粒缺少IV型分泌系统基因簇，为非接合型，它的转移机制尚不清楚。

为解析肺炎克雷伯菌非接合型毒力质粒的转移机制，来自生命科学技术学院和瑞金医院的多个团队开展深入的合作研究。首先，构建了hvKP低粘液表型突变株作为供体菌，以一系列CRKP临床分离株为受体菌，在接合实验中观察到了pLVPK样非接合型毒力质粒从hvKP转移到CRKP。其次，对接合子开展脉冲场凝胶电泳分析和全基因组测序，实验结果表明，在IncF接合质粒的辅助下，毒力质粒的非自主转移存在多种复杂的形式。本研究观测到的转移形式包括：（1）毒力质粒单独转移，（2）毒力质粒与IncF接合质粒共同转移，和（3）毒力质粒和IncF接合质粒形成杂合质粒进而转移。既往报道的含有耐药基因和毒力基因的杂合质粒被认为是通过同源重组或IS26介导等方式形成；而本研究发现了另一种杂合质粒形成的方式，即在特定的28-bp位点发生两次DNA单链切割和交换而形成融合。在GenBank收录的2608个肺炎克雷伯菌质粒基因组中，99%毒力质粒和32%接合质粒含有该28-bp融合位点（rfsF）。最后，在大肠杆菌中模拟了毒力质粒和IncF接合质粒的转移互作。使用前期开发的生物信息学软件工具oriTfinder来识别质粒接合转移的4个主要功能组件，包括接合转移起始位点 (oriT) 、松弛酶、四型伴侣蛋白和四型分泌系统等。在毒力质粒中识别到了一个新的oriT，其nic缺刻位点与IncF接合质粒的相似。随后构建了含有毒力质粒oriT的模拟毒力质粒、缺失oriT的IncF质粒、和缺失IV分泌系统的IncF质粒，采用多组接合实验进一步确定了毒力质粒可借助IncF接合质粒形成的IV型分泌系统进行非自主转移。此外，还发现了肺炎克雷伯菌胞外多糖的高表达会限制毒力质粒的转移，大肠杆菌可作为中间媒介辅助毒力质粒从hvKP间接进入CRKP。以上研究表明，肺炎克雷伯菌的耐药质粒和毒力质粒之间存在转移互作，可能极大促进耐药与毒力这两种重要性状在病原细菌中的共同播散。（生物谷 bioon）