深度解析为何新型冠状病毒更易于在人间传播扩散 病毒S蛋白与宿主细胞受体ACE2的亲和力竟是SARS的10-20倍！

2020年2月20日 讯 /生物谷BIOON/ --最近在中国爆发的新型冠状病毒（2019-nCoV）感染疫情如今已经被列为国际关注的突发公共卫生事件，这种病毒会引起发烧、严重呼吸道疾病和肺炎症状；冠状病毒的S糖蛋白（spike glycoprotein）是开发新型疫苗、治疗性抗体和诊断技术的关键靶点。2月19日，刊登在Science杂志上一篇题为“Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation”的研究论文中，来自美国德克萨斯大学和国家过敏和传染病研究所的研究人员通过联合研究利用冷冻电镜技术解析了新型冠状病毒S蛋白的结构，深入研究后，研究者发现，新冠病毒S蛋白与宿主细胞ACE2之间的亲和力是SARS的10-20倍，相关研究结果或为后期疫 苗和新型抗病毒药物的提供新的思路和研究基础。

新型冠状病毒S蛋白在融合前构象中的结构

图片来源：Daniel Wrapp，et al.

据WHO 2月10日数据显示，目前全球有超过4万例确诊病例，已经造成了至少900人死亡，这种冠状病毒被认为是一种新型冠状病毒（2019-nCoV），其与多种蝙蝠冠状病毒及SARS冠状病毒具有高度相似性；相比SARS冠状病毒而言，新型冠状病毒似乎更容易人传人，其能在几个大洲快速传播，并让WHO宣布全球进入公共卫生应急状态。新型冠状病毒能利用一种紧密糖基化的、同源三聚体I类融合凸起蛋白（S蛋白）来进入宿主细胞中，S蛋白能以一种相对稳定的融合前构象存在，并经历剧烈的结构重排来促进病毒膜结构与宿主细胞膜进行融合，这一过程是由病毒S1亚单位与宿主受体的结合所诱发，其能破坏融合前三聚体的稳定性，从而导致S1亚单位脱落，并促使S2亚单位转变为高度稳定的融合后构象。为了能与宿主受体相结合，S1的受体结合结构域会经历链状样的构象运动，这种运动方式会暂时隐藏或暴露受体结合的决定因素，这两种状态被认为是“向上”或“向下”构象，其中向下的构象对应的是受体不可及的状态，而向上构象则对应着受体可达的状态，后者被认为具有不稳定。由于S蛋白不可或缺的功能，因此其有望成为抗体所介导的中和作用的易感性靶点，而融合前的S结构则能够提供原子水平的信息来帮助指导科学家们进行疫苗的设计和开发。

基于此前研究人员所报道的新型冠状病毒基因组序列，这项研究中，研究人员表达了新型冠状病毒的胞外域1-1208的残基，同时基于此前的稳定化策略（对β冠状病毒S蛋白非常有效）在S2融合机器的C末端添加了两个稳定的脯氨酸突变，研究者从293个细胞中获得了约为0.5mg/L的重组融合前稳定的S胞外域结构，同时利用亲和色谱和尺寸排阻色谱技术对蛋白质进行了纯化，随后研究者利用纯化且完全糖基化的S蛋白制备了Cryo-EM（冷冻电镜）网格。

当研究人员收集并加工处理了3207张显微照片后，他们获得了一个3.5埃分辨率的3D非对称三聚体的重建图像，其中能在“向上”的结构域中观察到单一的受体结合域，由于受体结合域的尺寸较小（0-21kDa），因此在进行三维重建和分类之前，这种构象的对称性或许并不明显。在cryoSPARC v2算法中3D可变性特征的帮助下，研究人员就能够在受体结合域进行链状移动时观察到S1亚单位的结构，这种运动或许就会导致S1相对于更稳定的S2而言表现出局部分辨率较低的状况。这种看似随机的受体结合域移动也能够在SARS冠状病毒MERS冠状病毒，甚至亲缘关系较远的猪流行性腹泻病毒中都能观察到，在新型冠状病毒S蛋白中所观察到的结果就表明，其或许拥有被认为在冠状病毒科保守的相同诱发机制，其中受体与暴露的受体结合域的结合会引发不稳定构象的产生，从而导致S1亚单位脱落，S2亚蛋白重新发生折叠。

由于S2亚单位似乎是一种对称的三聚体，因此研究人员对其进行了3D精细化处理使其具有C3对称性，这样就生成了一个3.2埃分辨率的图谱，其所呈现的S2亚单位的致密度较好，利用上述图谱，研究人员构建了新型冠状病毒的大部分胞外域区域，其中包括每个三聚体上的66个连接糖基化位点中的44个糖基化位点，研究者所得到的最终模型跨越了S残基22-1146（位点），其中省略了一些灵活的环路；与此前所报道的所有冠状病毒的胞外域结构一样，新型冠状病毒S蛋白的密度在连接域后也开始下降，从而就反映出了融合前构象中七肽重复区2结构域（HR2，heptad repeat 2）的灵活性。

新型冠状病毒S蛋白的整体结构类似于SARS冠状病毒S蛋白的结构，其二者在超过959个Cα原子上的均方根偏差（RMSD）为3.8埃（A），它们之间在结构上最大的差异是其各自“向下”构象中受体结合结构域位置之间的构象差异，处于“向下”构象的SARS冠状病毒受体结合结构域能与相邻原聚体的N末端结构域紧密结合，而新型冠状病毒的的受体结合结构域的角度则更接近同源三聚体的中心腔位置；尽管存在一定的构象差异，但当新型冠状病毒S蛋白的单一结构域与SARS冠状病毒S蛋白对应结构域对齐时，它们就能够反映两种蛋白之间较高程度的结构同源性。

新型冠状病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13的S蛋白的序列同源性大约为96%，最明显的变化源于S1/S2蛋白酶切割位点的插入，从而导致新型冠状病毒出现了“RRAR”成对碱性氨基酸蛋白酶的识别位点，而不是SARS冠状病毒中的单一精氨酸位点；目前研究人员已经在流感病毒中观察到了类似的现象，即在高毒性禽流感病毒和人流感病毒中的相关位置所发现的能产生多元成对碱性氨基酸蛋白酶位点的氨基酸插入。除了S1/S2连接处插入的残基外，新型冠状病毒的S蛋白和RaTG13的S蛋白之间还存在29个可变的残基，其中17个残基位置能够映射到受体结合结构域中；随后研究人员分析了来自全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）中61个可用的新型冠状病毒S蛋白的序列，结果发现，所有序列中仅存在9个氨基酸的替换，大部分替换都是保守性的，而且研究者预测，其也不会对新型冠状病毒的S蛋白的功能或结构产生明显影响。

有研究表明，新型冠状病毒的S蛋白和SARS冠状病毒S蛋白拥有相同功能的宿主细胞受体，即血管紧张素转换酶2（ACE2，angiotensin converting enzyme2），这就促使了研究人员通过表面等离子体共振技术（SPR，surface plasmon resonance）来研究介导这种相互作用的动力学特性，让研究人员惊讶的是，ACE2与新型冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合的亲和力为15 nM（平衡解离常数），其是ACE2与SARS冠状病毒S蛋白胞外域结构之间结合亲和力的10-20倍。 此外，研究人员还制造了ACE2与新型冠状病毒S蛋白胞外域结合的复合体，并利用负染色电镜技术对其进行观察，结果发现，该复合体与SARS冠状病毒S蛋白-ACE2复合体的结构（利用高分辨率的冷冻电镜技术观察）非常相似；新型冠状病毒对人类ACE2的高亲和力或许有助于解释为何该病毒易于在人与人之间进行传播扩散，但后期还需要研究人员进一步深入研究来阐明。

新型冠状病毒S蛋白和SARS冠状病毒S蛋白之间总体的结构同源性和共享受体使用或能帮助我们检测已经公布的SARS冠状病毒受体结合结构域定向单克隆抗体与新型冠状病毒受体结合结构域之间的交叉反应特性；目前研究者已经对新型冠状病毒受体结合结构域的SD1片段（S蛋白残基319-591）进行了重组表达，并利用生物层干涉技术（BLI）测定ACE2的结合水平来证实这种重组体的折叠状况，随后研究者利用BLI来评估SARS冠状病毒受体结合结构域定向单克隆抗体S230、m396和80R的交叉反应特性。尽管新型冠状病毒和SARS冠状病毒的受体结合结构域之间的结构同源性程度较高，但在1uM的测定浓度下，研究者并未发现上述三种抗体与新型冠状病毒受体结合结构域的结合，尽管三种抗体的抗原表位仅代表了新型冠状病毒受体结合结构域较小比例的表面面积，目前缺乏研究证据表明，SARS定向的单克隆抗体不一定具有交叉反应性，而后期研究人员或许也能利用新型冠状病毒的S蛋白作为探针来进行抗体的分离和治疗研究等工作。

新型冠状病毒在全球的传播扩散促使WHO将其认定为国际公共卫生紧急事件，目前研究人员迫切需要开发出针对该病毒的新型疫苗和治疗手段，而在原子水平下阐明新型冠状病毒S蛋白的精细化结构或有望帮助后期开发出新型抗病毒疗法和疫苗。（生物谷Bioon.com）

参考资料：

Daniel Wrapp， Nianshuang Wang， Kizzmekia S. Corbett， et al. Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation， bioRxiv (2020) doi：10.1101/2020.02.11.944462

Daniel Wrapp et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 2020, doi:10.1126/science.abb2507.