Science子刊：开发出一种大幅降低脱靶突变和在靶突变的基因编辑工具

分子工具CRISPR-Cas9可用于治疗遗传性血液疾病，但这可能会造成意外的遗传改变。在一项新的研究中，来自德国马克斯-德布吕克分子医学中心（MDC）的Klaus Rajewsky和Van Trung Chu及其研究团队提出了一种方法，将这种不良后果降到最低。相关研究结果近期发表在Science Advances期刊上，论文标题为“Precise CRISPR-Cas–mediated gene repair with minimal off-target and unintended on-target mutations in human hematopoietic stem cells”。

人们对CRISPR-Cas9基因编辑工具的治疗潜力寄予厚望。这些“分子剪刀”可以用来非常精确地切除和修复导致遗传性疾病的基因突变。但是，尽管该工具能够精确地在基因组中定位它的靶位点，它的作用还不是完全没有错误。

有时，CRISPR-Cas9在与靶序列非常相似却位于DNA的完全不同区域的位点进行切割。这些错误，科学家们称之为“脱靶突变（off-target mutation）”，可能会产生意想不到的后果。即使CRISPR-Cas9在正确的位点进行切割，当这种切割被修复时也可能发生错误---这种现象被称为“在靶突变（on-target mutation）”。

让切割位点分隔开

MDC免疫调节与癌症实验室负责人Klaus Rajewsky教授解释说，“这些错误的发生主要是因为在经典方法中，DNA分子的两条链都被一次性切割。”在这项新的研究中，这些作者提出了一种称为“spacer-nick”的新型改良方法。这种方法采用了一对改良的称为缺口酶（nickase）的分子剪刀，在DNA的两条链的不同位点上产生缺口。

但是这对用于基因编辑的缺口酶能够更精确地检测和修复有缺陷的基因，这在很大程度上取决于这些作者在这种基因编辑工具中内置的一个间隔序列（spacer）。Rajewsky实验室的科学家Van Trung Chu博士解释说，“我们使用这个间隔序列来确保所产生的两个缺口相隔200到350个碱基对，并避免发生DNA双链断裂。”Chu说，“我们针对造血干细胞和T细胞进行的实验表明，这是让在靶突变和脱靶突变最小化的最佳距离。这种距离再短一些，我们就有可能切割开整个DNA分子---尽管使用了两把独立的分子剪刀。”

MDC的Kathrin de la Rosa团队和Ralf Kühn团队也在这项新的研究中作出了贡献，特别是在检测脱靶突变方面。Rajewsky说，“因此，spacer-nick也是MDC不同实验室的研究人员之间成功合作的一个好例子。”

有效且几乎无差错

Chu报告说，他们甚至可以定量确定他们微调的基因剪刀的优越性：“使用经典的CRISPR-Cas9方法，在超过40%的干预中会发生在靶突变。这种spacer-nick系统可以将这一比例降至2%以下。”Chu解释说，脱靶突变的成功率不能很容易和准确地确定：“我们真正能说的是，当使用经典的基因剪刀时，脱靶突变发生得相对频繁，但在我们的方法中却很少发生，甚至不存在。暂时还不清楚的是，在spacer-nick切割之后，遗传物质被修复的确切机制。Chu说，“它似乎不是通过众所周知的---而且容易出错的---NHEJ途径发生的。”

AAV-seq和LAM-HTGTS分析AAV整合和复杂的遗传变异。图片来自Science Advances, 2022, doi:10.1126/sciadv.abm9106。

就有效性而言，spacer-nick与传统工具不相上下：Chu说，“通过这两种方法，我们能够成功修复20%～50%的受处理细胞。”他解释说，这可能足以治愈仅源于单一基因改变的遗传性血液疾病患者。这种疾病的例子包括β地中海贫血症，它涉及血红蛋白的错误合成；严重的先天性中性粒细胞减少症，其特点是粒细胞（一种白细胞）的数量明显减少，并与严重削弱的免疫防御有关。

修复造血干细胞

Chu和Rajewsky希望其他研究人员能接受他们的想法，并测试spacer-nick---首先在动物模型中，然后很快在第一批人类患者身上。Chu解释说，该疗法的原理很简单。用既定的方法从单基因遗传性疾病患者身上提取造血干细胞。然后，Spacer-nick直接在体外培养的造血干细胞中修复有缺陷的基因。一旦基因剪刀完成任务，修复后的造血干细胞将被给送回患者体内，在那里产生新的、最重要的健康血细胞。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

1. Ngoc Tung Tran et al. Precise CRISPR-Cas–mediated gene repair with minimal off-target and unintended on-target mutations in human hematopoietic stem cells. Science Advances, 2022, doi:10.1126/sciadv.abm9106.

2. A fine-tuned gene editor
https://www.mdc-berlin.de/news/press/fine-tuned-gene-editor-crispr-cas9-spacer-nick