Circulation ：熬夜不睡，心脏遭罪！我国学者揭示生物钟对心脏健康的影响
来源：生物世界 2022-02-03 09:43
昼夜节律紊乱，如熬夜不睡、夜班工作，可能会对健康产生多种不良影响。其中，也与心脏疾病的发生有关，目前尚不清楚心脏分子时钟功能障碍是否与自然发生的人类心脏病进展有关。核受体 Rev-erbα/β 是生物钟的关键组成部分，已成为心脏病的药物靶点，但心脏 Rev-erb 的功能在体内尚未得到研究。美国德克萨斯州贝勒医学院孙正，中国医学科学院宋江平，和中国温州医科大
昼夜节律紊乱，如熬夜不睡、夜班工作，可能会对健康产生多种不良影响。其中，也与心脏疾病的发生有关，目前尚不清楚心脏分子时钟功能障碍是否与自然发生的人类心脏病进展有关。核受体 Rev-erbα/β 是生物钟的关键组成部分，已成为心脏病的药物靶点，但心脏 Rev-erb 的功能在体内尚未得到研究。
美国德克萨斯州贝勒医学院孙正，中国医学科学院宋江平，和中国温州医科大学附属第二医院等多家单位合作，在 Circulation 期刊发表了题为 ：Myocardial Rev-erb-Mediated Diurnal Metabolic Rhythm and Obesity Paradox 的研究论文，
该研究发现，心肌细胞中的 Rev-erbα/β 介导正常的代谢节律，使心肌细胞在小鼠休息时间（白天）更喜欢脂质作为能量来源，去除 Rev-erbα/β 会破坏这种节律，降低心肌细胞在休息时间使用脂质的能力，并导致进行性扩张型心肌病和致命的心力衰竭。
Rev-erbα 和 Rev-erbβ 在昼夜节律中具有高度序列同源性。因此，研究者构建了心肌细胞特异性 Rev-erbα/β 双基因敲除小鼠。
超声心动图显示 KO 小鼠在 2.5 月龄时左心室大小、壁厚和收缩功能正常；然而，在 4.5 月龄时，KO 小鼠显示出收缩功能受损，左心室直径增大，但心室壁没有明显增厚；到 6 个月大时，射血分数下降到 20-30%，左心室进一步扩张；雌性 KO 小鼠在 6 个月时也出现类似的收缩功能障碍和心脏扩张。
KO 小鼠的收缩功能障碍与心钠素（ANP）和 B 型利钠肽（BNP）表达升高和心脏明显增大有关。左心室 KO 心脏扩张但无明显纤维化。大多数 KO 小鼠在 6-8 个月大时死亡。总之，Rev-erbα/β 心肌细胞特异性敲除导致进行性收缩功能障碍，导致扩张型心肌病（DCM）和致死性心力衰竭。
研究者分析了年轻时 KO 小鼠的基因表达，以排除收缩功能障碍的继发影响。在小鼠 2 个月大时，在授时因子时间（Zeitgeber time， ZT， 即由实验室所订的环境时间，在节律研究中人为控制光照）2、6、10、14、18 和 22 时，收集一次心室心脏组织，并在每个 ZT 点上鉴定 KO 和 WT 之间的差异表达基因。
每个 ZT 上大约 25-35% 的差异表达基因是其独有的。常见差异表达基因在所有 6 个 ZT 上的倍数变化也显示出强大的 ZT 特异性差异。上调的差异表达基因在细胞粘附和昼夜节律中富集，而下调的差异表达基因在代谢过程中富集，尤其是脂肪酸氧化，支持 Rev-erb 在心肌能量代谢中的核心作用。
许多参与脂肪酸代谢的差异表达基因，在 WT 小鼠心脏中表现出昼夜振荡，峰值表达围绕着从亮到暗的过渡，在 KO 小鼠心脏中的时间模式被破坏，呈现恒定的低表达水平。相比之下，在参与葡萄糖代谢的差异表达基因中，许多在 KO 心脏中获得了更明显的振荡模式，在暗周期中表达峰值。这些结果表明，KO 小鼠的心脏减少了脂肪酸氧化，特别是在光周期后期，并增强了葡萄糖利用，特别是在黑暗周期后期。因此，心脏 Rev-erb 的生理作用是在光照周期中增强脂肪酸氧化基因，但在暗周期中抵抗葡萄糖代谢基因激活。
研究者在小鼠 2.5 个月大时，在 ZT9 和 ZT21 两个时间点分离心肌细胞核，并进行 Rev-erbα Chipseq。ZT9 时心肌细胞中 Rev-erbα 的全基因组结合峰是 ZT21 的五倍。经典 Rev-erb 靶基因 Bmal1 和 E4bp4 在启动子中携带强 Rev-erb 峰。
E4bp4 是 Rev-erb 缺失的心肌细胞中与改变的组蛋白乙酰化标志物具有高度结合相似性的转录因子。E4bp4 是已知的转录抑制因子，也是 Rev-erb 的靶标，在 ZT9 的转录起始位点处具有稳健的 Rev-erbα 峰。E4bp4 表达在 KO 与 WT 心脏中上调。
此外，已知 E4bp4 调节肠道和肝脏中的脂质代谢。这些观察结果促使研究者探索上调的 E4bp4 是否解释了 KO 心肌细胞中下调的脂质代谢基因。在 AC16 心肌细胞中敲低 Rev-erbα/β，下调了脂肪酸氧化基因和脂肪酸氧化通量率，并增加了葡萄糖摄取。与单独的 Rev-erb 敲低相比，Rev-erbα/β 和 E4bp4 的联合敲低挽救了脂肪酸氧化基因的表达和脂肪酸氧化通量。
为了解心脏 Rev-erb 如何调节心肌蛋白含量，研究者在 10 周龄时对 WT 和 KO 小鼠心脏的 ZT6、ZT14 和 ZT22 进行了蛋白质组学分析。在每个样品中检测和量化了超过 4，000 种蛋白质。
在每个 ZT 时，KO 与 WT 相比，上调的蛋白大约是下调蛋白的 3 倍。差异表达的蛋白高度依赖于 ZT，每个 ZT 处只有 17-22% 的差异表达蛋白与其他 ZT 相同。尽管不同 ZT 的差异表达蛋白在单个蛋白质水平上的重叠有限，但它们在能量代谢过程中具有共同的功能富集。这些发现进一步支持心脏 Rev-erb 调节能量代谢的昼夜节律。
3 个月大的脂质组学分析确定了 180 种脂质，主要是心磷脂和甘油磷脂，在 WT 心脏中显示出强烈的昼夜节律，但只有 28 种脂质在 KO 心脏中保持相同的节律性。除了节律性丧失外，KO 心脏还显示出超过 100 种脂质（主要是甘油脂）的节律性显着增加。这导致了 KO 与 WT 心脏节奏的整体翻转。WT 心脏中的大多数振荡脂质在 ZT10 处的含量高于 ZT22，而 KO 心脏中的大多数振荡脂质在 ZT22 处高于 ZT10。
10 周龄时的代谢组学分析表明，对于短链酰基肉碱和 TCA 中间体，WT 心脏没有表现出太多的振荡。对于长链酰基肉碱和乙酰辅酶 A 下游的 TCA 代谢物，例如柠檬酸盐和乌头酸盐，ZT6 的 KO/WT 差异比 ZT18 更突出，这与光照周期比黑暗周期损害更显着的结果一致。
对于与碳水化合物代谢密切相关的 TCA 中间体，如苹果酸和富马酸，以及一些氨基酸和多胺，ZT18 的 KO/WT 差异比 ZT6 更突出，这与增加的碳水化合物代谢一致。多组学数据的综合分析表明，KO 与 WT 心脏中的氧化脂质代谢总体减少，特别是在光照周期中，糖酵解的相互增加，特别是在黑暗周期中。这些结果表明，Rev-erb 消耗会损害氧化代谢，并在心脏收缩功能障碍之前影响代谢。
研究人员提出猜想，如果脂肪酸氧化受损是导致 KO 小鼠对碳水化合物的偏好并导致心力衰竭的原因，则有可能通过提高脂肪酸氧化的能力来减轻其对糖酵解的过度依赖，达到缓解收缩功能障碍的目的。
由于高脂肪饮食可以上调心脏中与 ppar α 相关的脂肪酸氧化基因，并使心脏糖酵解与葡萄糖氧化分离，研究者试图通过从 8 周龄开始饲喂高脂肪无蔗糖饮食来验证这一假设。但与他们的预期相反，5 个月大小鼠的超声心动图并没有显示心脏功能的改善，并且高脂肪无蔗糖饮食没有改变 KO 小鼠心脏中脂质代谢基因或蛋白质的表达。
除了黑暗周期中的膳食脂质外，脂肪分解释放游离脂肪酸作为心脏脂质的另一个主要来源，尤其是在光照周期中。与对照饮食相比，高脂肪无蔗糖饮食仅导致体重、葡萄糖耐受不良、基线胰岛素水平和胰岛素抵抗的 HOMA 指数轻度增加，而不影响血清酮、WT 和 KO 小鼠中的脂肪酸水平。高脂肪无蔗糖饮食下的 KO 小鼠的葡萄糖耐量略有改善，这与过度依赖葡萄糖利用是一致的。这些数据表明，在黑暗周期中增加膳食脂质供应本身，并不能挽救 KO 小鼠的心脏功能障碍。
高脂肪高蔗糖饮食不仅增加了黑暗周期中的膳食脂质，而且在 3 个月后体重增加超过 10 g，还导致更严重的葡萄糖耐受不良、更高的基线胰岛素水平、更高的胰岛素抵抗 HOMA 指数，和光周期中更高的游离脂肪酸。值得注意的是，高脂肪高蔗糖饮食在光照周期中部分逆转了下调的脂肪酸代谢基因和蛋白质，但在黑暗周期中没有。这些结果表明，光周期中增加的游离脂肪酸，上调了脂质代谢基因的表达，可能是通过脂质传感信号通路。
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