Nat Biotechnol：构建出具有自我编辑活性的DNA碱基编辑器
来源：本站原创 2019-09-21 17:30
2019年9月21日讯/生物谷BIOON/---2016年，Komor等人利用16个碱基长的XTEN接头（XTEN linker）将大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1与dCas9连接在一起，从而构建出第一代碱基编辑器（BE1）。BE1表现出大约5个核苷酸的活性窗口（activity window）：靶位点4～8。为了增加体内编辑效率，第二代碱基编辑器（BE2）系统除了将胞苷脱氨酶与dCas9连接在一起之
2019年9月21日讯/生物谷BIOON/---2016年，Komor等人利用16个碱基长的XTEN接头（XTEN linker）将大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1与dCas9连接在一起，从而构建出第一代碱基编辑器（BE1）。BE1表现出大约5个核苷酸的活性窗口（activity window）：靶位点4～8。
为了增加体内编辑效率，第二代碱基编辑器（BE2）系统除了将胞苷脱氨酶与dCas9连接在一起之外，还将碱基切除修复抑制剂UGI与dCas9融合在一起，从而将编辑效率提高三倍，最高达到20%左右。对BE1和BE2而言，碱基插入或删除（insertion or deletion, indel）发生率是非常低的（<0.1%），这是因为它们并不直接切割DNA。
为了将碱基编辑效率提高到50％以上，人们需要采取一种方法将靶DNA链上的碱基编辑复制到另一条DNA链上。为了做到这一点，Komor等人将dCas9换为Cas9n来模拟错配修复，从而构建出第三代碱基编辑器（BE3）。BE3在非互补DNA链上产生切口，使得它在细胞看来是“新合成的”。因此，细胞使用含尿嘧啶（U）的DNA链作为模板来进行修复，从而复制这种碱基编辑。
第三代碱基编辑能够产生复杂的产物；人们已观察到不想要的C->G或C->A转换，而不是始终如一的C-> T转换。2017年，Komor等人猜测这些副产物是在碱基切除修复期间尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）切除引起的。虽然第三代碱基编辑器包含UNG抑制剂UGI，但是添加第二个UGI拷贝可提高碱基编辑产物的纯度。此外，Komor等人通过延长APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI中的接头长度提高了碱基编辑产物的纯度，这三项改进一起代表了第四代碱基编辑器（BE4）。与BE3相比，BE4使得C->G和C->A基因编辑产物减少了2.3倍，并且让indel发生率减少了2.3倍。
直到最近，碱基编辑仅限于靶DNA链上的C->T转换，或互补DNA链上的G->A转换，因此BE1、BE2、BE3和BE3都属于胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。Gaudelli等人寻求构建腺嘌呤碱基编辑器（ABE），它将腺嘌呤转化为肌苷，从而导致A->G变化。他们最终成功构建出四种ABE：ABE7.10、ABE 6.3、ABE 7.8和ABE 7.9。
然而，2019年4月，Julian Grünewald等人已证实CBE和ABE也能够诱导全转录组范围内的不依赖于向导RNA（gRNA）的RNA碱基编辑，并且构建出降低不想要的RNA编辑活性的SECURE-BE3变体（详细报道参见生物谷新闻：Nature：震惊！CRISPR碱基编辑器能够诱导大量的脱靶RNA编辑）。
在一项新的研究中，Julian Grünewald等人描述了对SECURE-BE3变体进行结构引导的改造，其中SECURE-BE3变体具有下降的脱靶RNA编辑活性和可比较的在靶DNA编辑活性，也是迄今为止描述的最小酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9碱基编辑器之一。相关研究结果发表在2019年9月的Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities”。
他们还测试了基于除APOBEC1以外的胞苷脱氨基酶的CBE，结果发现基于人APOBEC3A的CBE诱导大量的RNA碱基编辑，然而基于APOBEC3A的增强型CBE6、基于人激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase）的CBE7和基于七鳃鳗（Petromyzon marinus）胞苷脱氨酶的CBE Target-AID4诱导较少的RNA编辑。
最后，他们发现表现出RNA脱靶编辑活性的CBE和ABE也能够对它们自身的转录本进行自我编辑，从而导致碱基编辑器编码序列出现异质性。（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
Julian Grünewald et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6.
为了增加体内编辑效率，第二代碱基编辑器（BE2）系统除了将胞苷脱氨酶与dCas9连接在一起之外，还将碱基切除修复抑制剂UGI与dCas9融合在一起，从而将编辑效率提高三倍，最高达到20%左右。对BE1和BE2而言，碱基插入或删除（insertion or deletion, indel）发生率是非常低的（<0.1%），这是因为它们并不直接切割DNA。
为了将碱基编辑效率提高到50％以上，人们需要采取一种方法将靶DNA链上的碱基编辑复制到另一条DNA链上。为了做到这一点，Komor等人将dCas9换为Cas9n来模拟错配修复，从而构建出第三代碱基编辑器（BE3）。BE3在非互补DNA链上产生切口，使得它在细胞看来是“新合成的”。因此，细胞使用含尿嘧啶（U）的DNA链作为模板来进行修复，从而复制这种碱基编辑。
第三代碱基编辑能够产生复杂的产物；人们已观察到不想要的C->G或C->A转换，而不是始终如一的C-> T转换。2017年，Komor等人猜测这些副产物是在碱基切除修复期间尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）切除引起的。虽然第三代碱基编辑器包含UNG抑制剂UGI，但是添加第二个UGI拷贝可提高碱基编辑产物的纯度。此外，Komor等人通过延长APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI中的接头长度提高了碱基编辑产物的纯度，这三项改进一起代表了第四代碱基编辑器（BE4）。与BE3相比，BE4使得C->G和C->A基因编辑产物减少了2.3倍，并且让indel发生率减少了2.3倍。
直到最近，碱基编辑仅限于靶DNA链上的C->T转换，或互补DNA链上的G->A转换，因此BE1、BE2、BE3和BE3都属于胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。Gaudelli等人寻求构建腺嘌呤碱基编辑器（ABE），它将腺嘌呤转化为肌苷，从而导致A->G变化。他们最终成功构建出四种ABE：ABE7.10、ABE 6.3、ABE 7.8和ABE 7.9。
然而，2019年4月，Julian Grünewald等人已证实CBE和ABE也能够诱导全转录组范围内的不依赖于向导RNA（gRNA）的RNA碱基编辑，并且构建出降低不想要的RNA编辑活性的SECURE-BE3变体（详细报道参见生物谷新闻：Nature：震惊！CRISPR碱基编辑器能够诱导大量的脱靶RNA编辑）。
图片来自Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6。
在一项新的研究中，Julian Grünewald等人描述了对SECURE-BE3变体进行结构引导的改造，其中SECURE-BE3变体具有下降的脱靶RNA编辑活性和可比较的在靶DNA编辑活性，也是迄今为止描述的最小酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9碱基编辑器之一。相关研究结果发表在2019年9月的Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities”。
他们还测试了基于除APOBEC1以外的胞苷脱氨基酶的CBE，结果发现基于人APOBEC3A的CBE诱导大量的RNA碱基编辑，然而基于APOBEC3A的增强型CBE6、基于人激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase）的CBE7和基于七鳃鳗（Petromyzon marinus）胞苷脱氨酶的CBE Target-AID4诱导较少的RNA编辑。
最后，他们发现表现出RNA脱靶编辑活性的CBE和ABE也能够对它们自身的转录本进行自我编辑，从而导致碱基编辑器编码序列出现异质性。（生物谷 Bioon.com）
参考资料：
Julian Grünewald et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6.
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