外泌体在缺血性脑卒中的研究进展

1.外泌体概述

外泌体是直径在30~100nm的胞外囊泡，通过细胞被释放到细胞外液中。它们存在于生物体液中，诸如血液和脑脊液。外泌体携带有DNA、RNA、蛋白质和脂质等。由于外泌体的微泡结构为其内在的小分子提供了一个安全稳定的环境，同时这些信号小分子利用循环系统在胞间信号交换发挥重要作用，这让外泌体表现出一个成熟、稳定的信号传输系统。

研究发现，外泌体中的mRNA和microRNA(miRNA)可从一个细胞转移到另一个细胞中，并在新的细胞中发挥功能。因此，外泌体是理想的细胞间信息传递媒介。外泌体通过如下3种方式进行细胞间信息传递：膜融合后内容物释放、膜表面信号分子以及信号分子胞外释放。细胞可通过分泌外泌体对各种刺激作出应答，在肿瘤组织中，肿瘤局部缺氧可以促进乳腺癌细胞释放更多的外泌体进入肿瘤微环境，进而促进肿瘤细胞的生存和侵袭。外泌体含有丰富的生物信息物质，具有在细胞间传递生物信息的独特功能，新近研究发现外泌体在机体各种重要生理及病理生理过程中发挥着越来越重要的作用。

2.外泌体对缺血组织的保护作用

研究发现，血管内皮细胞在受到低氧刺激时能反应性地增加外泌体分泌，这些受低氧刺激分泌的外泌体，可被邻近细胞摄取，或通过循环传输被远处细胞摄取。研究发现人体多种脏器，如心脏和脑等器官都能通过远程缺血预处理提高缺血耐受能力。Vicencio等发现，在缺血处理后，血浆内外泌体大量增加，这些内源性外泌体通过外泌体表面膜蛋白，如热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70能够呈递信号给心脏组织，激活心肌细胞膜表面的Toll样受体4，活化细胞外信号调节激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路，诱导HSP27磷酸化，从而提高心肌对于缺血再灌注损伤的耐受，达到心肌保护作用。

循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分泌的外泌体，通过转运磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路相关mRNA，激活血管内皮细胞受体，并促进内皮细胞的增殖和成管，同时，EPCs来源外泌体内携带有促血管生成miRNA-126和miRNA-296，能上调血管生成因子，促进血管内皮细胞的增殖和分化，从而发挥其抗凋亡作用。

通过进行基因芯片分析中风组与非中风组动物的脑血管内皮细胞与神经祖细胞所分泌的外泌体中成分，发现2组外泌体内的蛋白质和miRNA均有大幅不同，这提示中风能够改变脑血管内皮细胞与神经祖细胞外泌体内成分。此外，缺血组神经祖细胞分泌的外泌体能够促进内皮细胞的迁移和成管，反之，缺血组内皮细胞外泌体能够提高神经祖细胞的增殖与分化能力。这说明了卒中后脑血管内皮细胞与神经祖细胞能通过分泌外泌体，相互协调和促进神经发生与血管形成，从而发挥对缺血组织的保护作用。

3.外泌体与神经保护

短暂或更为持久的局灶性脑缺血引起的脑卒中涉及一系列病理生理反应，其中大脑损伤会产生并累积相关毒性蛋白，它们的降解与Nedd4家族相互作用蛋白1(Nedd4 family interacting protein1，Ndfip1)和泛素连接酶Nedd4的相互作用相联系。Putz等发现神经元来源的外泌体内含有Ndfip1和Nedd4，Ndfip1与泛素连接酶Nedd4能发挥损伤后移除毒性蛋白的功能。Bianco等已经证实在损伤的神经组织中，胞外ATP水平升高，使小胶质细胞和星形胶质细胞释放外泌体，同时这些外泌体包含炎症细胞因子白细胞介素1β，诱导炎症反应。

在此应激条件下，星形胶质细胞会释放含有突触小泡相关的具有神经元特异性的磷酸蛋白质---突触蛋白的外泌体。同时，少突胶质细胞来源外泌体内含髓磷脂和应激蛋白质。外泌体通过递送这些mRNA和蛋白质，在损伤神经再生方面发挥重要功能。

Zhang等发现间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源外泌体可通过减轻炎症反应并且促进血管新生和神经发生，从而有效促进创伤性颅脑损伤(traumitic brain injury，TBI)大鼠的功能恢复；Xin等的研究结果同样表明，MSCs来源外泌体可通过促进神经血管再生来改善神经功能。其后，又陆续有研究证明MSCs来源外泌体在脑卒中与脑损伤动物模型中的治疗效益，并发现其有明显改善运动协调的功能和大幅度保留空间学习的能力。

4.外泌体与神经血管单元

神经血管单元是由内皮细胞、血管平滑肌、神经胶质细胞、神经元及相关组织基质蛋白组成的，卒中后的内源性脑修复涉及到神经血管单元及神经干细胞一系列高度精密的交叉式反应，如血管再生和神经发生等，它们共同协调神经修复。外泌体在这一系列过程中发挥巨大作用。

4.1外泌体与神经再生

神经元与胶质细胞来源外泌体能够调节神经元和胶质细胞之间的细胞信号转导，影响轴突生长和髓鞘形成。皮质神经元外泌体携带有L1细胞黏附分子和谷氨酸受体2/3亚基，胞内Ca2+水平增加会促进外泌体的分泌。当去极化神经元的神经突分泌外泌体时，会使外泌体内富含微管相关蛋白1b和神经突重塑相关的靶向miRNA。此外，神经元来源外泌体内有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受体，AMPA受体的激活有助于脑卒中后运动功能的复原。

在成人中枢神经系统中，抑制神经元第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)信号与减少星形胶质细胞疤痕，有助于提高脊柱损伤及脑卒中后轴突出芽。Goncalves等发现，视黄酸受体β激动剂能使神经元细胞分泌富含PTEN蛋白的外泌体，这些外泌体能抑制皮质神经元PTEN信号通路；转运PTEN蛋白至胶质细胞，可抑制胶质细胞的增殖，对神经元及胶质细胞产生双重影响。Morel等进一步证实，皮质神经元外泌体转运mi-RNA-124至胶质细胞，提高谷氨酸转运体1的表达，从而调节胶质细胞功能。这些数据表明，神经元来源外泌体通过转运囊泡内活性物质，并与胶质细胞胞间信号转导，从而调节突触和轴突重塑。

4.2外泌体与血管新生

Notch信号通路与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信号通路的相互作用对介导血管再生和维持脑血管屏障完整至关重要。激活脑血管内皮细胞与周细胞内Notch通路，可促使脑血管再生并维持脑血管屏障的完整性。Yamamoto等发现，由小鼠脑血管内皮细胞分泌的外泌体，能增加受体细胞周细胞内VEGF-B的mRNA与蛋白表达水平，通过VEGF-B与受体VEGFR-1介导血管再生。

研究发现人脑微血管内皮细胞与人脐静脉内皮细胞来源的外泌体内含Delta-like ligand 4(Dll4)蛋白，Dll4能刺激周细胞上的Notch3受体，并保护脑血管结构稳定及调节血管再生。以上结果表明，脑血管内皮细胞外泌体通过传递生物信号至周细胞，并通过VEGF和Notch信号通路介导血管再生和维持脑血管屏障完整。Haqqani等发现，人脑微血管内皮细胞来源的外泌体内至少含有1179种蛋白，其中包括约60种标记蛋白，如Alix、TSG101、CD81和CD9等，同时，他们进一步发现，这些外泌体能够携带大分子蛋白穿越血脑屏障，其中包括转铁蛋白受体、胰岛素受体、LRP、LDL和TMEM30A等。

此外，Skog等发现，胶质母细胞瘤分泌的外泌体富含促血管生成蛋白，而脑微血管内皮细胞可以吸收这些外泌体，从而诱导血管新生。

5.外泌体在脑卒中的研究进展

近年来，随着对外泌体研究的深入，已证实外泌体调控的细胞间信息交流过程也广泛参与了脑血管系统的生理、病理过程，并在脑卒中疾病发生发展机制中扮演着重要的角色。Chen等通过收集急性脑卒中病人的血样本后分析发现，与阴性对照组相比，缺血组外泌体内miRNA-223含量显着上调，并且外泌体内miRNA-223的表达量与急性脑卒中的发生、严重程度及短期预后相关。

血浆内皮细胞来源的外泌体(plasma endothelial cell-derived exosomes，EDEs)富含内皮细胞蛋白血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和内皮型一氧化氮合酶；具有内皮细胞特性，可以黏附、募集单核细胞引起炎症反应，提示EDEs在细胞炎症反应中起重要作用；有研究发现脑血管疾病的病人EDEs内VCAM-1、血管性血友病因子、血小板源生长因子BB、血管生成素1、赖氨酰氧化酶2以及脑血管选择性蛋白葡萄糖载体1等较对照组显着增高，这表明EDEs与脑血管疾病有着某种潜在联系。

目前，体内外实验均已证实MSCs外泌体在脑卒中后脑重塑中的治疗效益，外泌体能够呈递MSCs内的miRNA至受体细胞。目前已发现有超过700种miRNA在MSCs分泌的外泌体中，这些miRNA能与RNA诱导沉默复合体组件AGO2结合。Xin等发现，在缺血脑组织中miRNA-133b水平显着降低，然而，miRNA-133b能靶向调节结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和Ras基因家族成员A，从而促进轴突生长；同时，他们发现MSCs治疗能上调缺血脑组织中的miRNA-133b水平，并且，体内实验表明，MSCs与缺血脑细胞共同培养会促进MSCs分泌富含miRNA-133b的外泌体；此外，他们运用慢病毒转染技术分别制造miRNA-133b高、低表达的特异性外泌体，并发现相比于单纯给予未处理的MSCs外泌体，高表达和低表达miRNA-133b，分别能促进和抑制大鼠轴突重建与神经功能的恢复；高表达miRNA-133b外泌体抑制星形胶质细胞内CTGF表达，并促进皮质神经元神经突生长。

我们课题组通过体外实验发现，人脐静脉内皮细胞来源的外泌体能改变缺氧神经细胞内相关凋亡蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表达，同时促进细胞增殖、侵袭和迁移，从而协助神经细胞抵抗缺血再灌注损伤。另外，脑卒中会诱导外周血的免疫抑制，从而抑制神经功能的恢复，研究发现，MSCs外泌体除了与脑细胞相互作用，还能在外周血中与自然杀伤细胞和淋巴细胞相互作用，从而减弱缺血后的免疫抑制。

6.小结与展望

脑卒中后，外泌体在神经保护和神经功能修复这一系列过程中涉及到多种胞间信号通路的精密调控，神经血管单元的重建对神经功能修复有着举足轻重的影响；外泌体通过胞间信号沟通，靶向调节多种胞间信号通路，在调节脑卒中后的神经功能恢复中，具有巨大潜能。然而，有关脑卒中领域中外泌体的研究仍存在许多未知性，例如，脑卒中后，脑实质细胞或者远程器官如何通过细胞信号通路影响外泌体的分泌以及其内物质的改变，外泌体如何调控受体细胞内源性基因的表达等，这些问题都等待着我们一一探究。(生物谷Bioon.com）

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