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基因编辑大牛张锋利用基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK系统检测冠状病毒2019-nCoV

来源:本站原创 2020-02-16 18:12

2020年2月16日讯/生物谷BIOON/---最近的新型冠状病毒SARS-CoV-2(之前称为2019-nCoV,这种病毒感染导致的疾病称为COVID-19)疫情给全球健康带来了巨大挑战。为了应对这一全球挑战,美国布罗德研究所、麦戈文脑科学硏究所及其合作机构致力于提供潜在有用的信息,包括分享可能能够支持开发潜在诊断方法的信息。

作为采取的应对措施的一部分,张锋(Feng Zhang)、Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg开发了适用于纯化的RNA的研究方案,这可能有助于开发基于CRISPR的诊断方法来临床检测2019-nCoV。

这种初始的研究方案并不是诊断性的测试方法,而且尚未在患者样本上进行测试。任何诊断方法都需要针对临床用途进行开发和验证,并且需要遵循所有当地法规和最佳实践。尽管如此,这种研究方案仍然为使用试纸条建立基于SHERLOCK的2019-nCoV诊断方法提供了基本框架。

何为SHERLOCK系统?

2017年,张锋等人将一种靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相关酶(即Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具,即SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)。这种技术可能有朝一日被用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症。相关研究结果于2017年4月13日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在这种技术中,不同于靶向DNA的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a能够在切割它的靶RNA之后保持活性,而且可能表现出不加区别的切割活性,而且在一系列被称作“附带切割(collateral cleavage)”的作用当中,继续切割其他的非靶RNA。它采用一种不同的依赖体温的扩增过程来提高他们的测试样品中的DNA或RNA水平。一旦这种水平增加,他们利用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA,从而使得他们将这种靶向RNA 的CRISPR工具的灵敏度增加了一百万倍,而且这种工具能够在几乎任何环境下使用。

另外,这种CRISPR工具还包括一种RNA报告分子。当该报告分子被切割时,它会发出荧光。当Cas13a检测到靶RNA序列时,它的无区分的RNA酶活性(即附带切割活性)也会切割这种RNA报告分子,从而释放可检测到的荧光信号。

2018年,布罗德研究所核心成员Feng Zhang 教授和他的团队对SHERLOCK诊断平台进行一系列优化,开发出一种微型试纸条测试方法,在将试纸条浸入经过处理的样品中后,就会出现一条线来指示靶分子是否被检测到,从而允许用肉眼观察到测试结果,而无需使用昂贵的设备。相关研究结果发表在2018年4月27日的Science期刊上,论文标题为“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”。

他们让这种平台使用来自不同细菌种类的Cas13和Cas12a(以前称为Cpf1)酶来产生额外的信号。此外,他们还添加了一种额外的CRISPR相关酶(即Csm6)来放大检测信号,从而增加了SHERLOCK的灵敏度,并增加准确地定量确定样品中的靶分子水平和一次测试多种靶分子的能力。

针对2019-nCoVSHERLOCK实验方案

这种基于CRISPR-Cas13的SHERLOCK系统先前已显示出可以准确地检测患者样本中多种不同病毒的存在。这种SHERLOCK系统搜索独特的核酸序列并使用类似于妊娠测试条的试纸条提供视觉读数。将试纸条浸入准备好的样本中后,在它的表面上会出现一条线,指示待测病毒是否存在。
针对2019-nCoV的SHERLOCK研究方案。

这些研究人员通过使用合成的2019-nCoV RNA片段,设计并测试了两种向导RNA(gRNA),每种gRNA特异性地识别2019-nCoV的一种特征性的核酸片段。当与Cas13蛋白结合时,它们形成了一种能够检测2019-nCoV病毒RNA是否存在的SHERLOCK系统。

这个研究方案包括三个步骤。它可以用于测试当前从临床样本中提取的用于定量PCR(qPCR)测试的RNA:

步骤1:将提取出的RNA在42℃下等温扩增反应25分钟;

步骤2:让步骤1中的扩增产物与Cas13蛋白、gRNA和报告分子在37℃下孵育30分钟;

步骤3:将试纸条浸入步骤2中的反应产物溶液中,结果应当在5分钟内出现。

这种研究方案的详细细节可参照参考文献1。随着这些研究人员继续与世界各地寻求应对这次疫情的研究人员独立地开展实验和合作开展实验,对这种研究方案的更新将会不断进行。

下一步是什么

SHERLOCK诊断系统已在其他条件下中取得了成功。这些研究人员希望这种研究方案是朝着构建一种利用简单的读数检测患者样本中2019-nCoV是否存在的SHERLOCK系统迈出的有用的一步。进一步的优化、生产、测试和验证仍然是需要的。任何诊断方法都必须遵循所有当地法规、最佳实践和进行验证后,才能真正用于临床。这些研究人员将继续发布和分享研究方案更新,并欢迎来自科学界的更新。(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

1.A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics
https://broad.io/sherlockprotocol

2.Enabling coronavirus detection using CRISPR-Cas13: An open-access SHERLOCK research protocol
https://www.broadinstitute.org/news/enabling-coronavirus-detection-using-crispr-cas13-open-access-sherlock-research-protocol

3.Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 13 Apr 2017, doi:10.1126/science.aam9321.

4.Jonathan S. Gootenberg et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, Published online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aaq0179
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