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Nat Biotechnol:构建出具有自我编辑活性的DNA碱基编辑器

来源:本站原创 2019-09-21 17:30

2019年9月21日讯/生物谷BIOON/---2016年,Komor等人利用16个碱基长的XTEN接头(XTEN linker)将大鼠胞苷脱氨酶APOBEC1与dCas9连接在一起,从而构建出第一代碱基编辑器(BE1)。BE1表现出大约5个核苷酸的活性窗口(activity window):靶位点4~8。

为了增加体内编辑效率,第二代碱基编辑器(BE2)系统除了将胞苷脱氨酶与dCas9连接在一起之外,还将碱基切除修复抑制剂UGI与dCas9融合在一起,从而将编辑效率提高三倍,最高达到20%左右。对BE1和BE2而言,碱基插入或删除(insertion or deletion, indel)发生率是非常低的(<0.1%),这是因为它们并不直接切割DNA。

为了将碱基编辑效率提高到50%以上,人们需要采取一种方法将靶DNA链上的碱基编辑复制到另一条DNA链上。为了做到这一点,Komor等人将dCas9换为Cas9n来模拟错配修复,从而构建出第三代碱基编辑器(BE3)。BE3在非互补DNA链上产生切口,使得它在细胞看来是“新合成的”。因此,细胞使用含尿嘧啶(U)的DNA链作为模板来进行修复,从而复制这种碱基编辑。

第三代碱基编辑能够产生复杂的产物;人们已观察到不想要的C->G或C->A转换,而不是始终如一的C-> T转换。2017年,Komor等人猜测这些副产物是在碱基切除修复期间尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)切除引起的。虽然第三代碱基编辑器包含UNG抑制剂UGI,但是添加第二个UGI拷贝可提高碱基编辑产物的纯度。此外,Komor等人通过延长APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI中的接头长度提高了碱基编辑产物的纯度,这三项改进一起代表了第四代碱基编辑器(BE4)。与BE3相比,BE4使得C->G和C->A基因编辑产物减少了2.3倍,并且让indel发生率减少了2.3倍。

直到最近,碱基编辑仅限于靶DNA链上的C->T转换,或互补DNA链上的G->A转换,因此BE1、BE2、BE3和BE3都属于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)。Gaudelli等人寻求构建腺嘌呤碱基编辑器(ABE),它将腺嘌呤转化为肌苷,从而导致A->G变化。他们最终成功构建出四种ABE:ABE7.10、ABE 6.3、ABE 7.8和ABE 7.9。

然而,2019年4月,Julian Grünewald等人已证实CBE和ABE也能够诱导全转录组范围内的不依赖于向导RNA(gRNA)的RNA碱基编辑,并且构建出降低不想要的RNA编辑活性的SECURE-BE3变体(详细报道参见生物谷新闻:Nature:震惊!CRISPR碱基编辑器能够诱导大量的脱靶RNA编辑)。
图片来自Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6。

在一项新的研究中,Julian Grünewald等人描述了对SECURE-BE3变体进行结构引导的改造,其中SECURE-BE3变体具有下降的脱靶RNA编辑活性和可比较的在靶DNA编辑活性,也是迄今为止描述的最小酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9碱基编辑器之一。相关研究结果发表在2019年9月的Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities”。

他们还测试了基于除APOBEC1以外的胞苷脱氨基酶的CBE,结果发现基于人APOBEC3A的CBE诱导大量的RNA碱基编辑,然而基于APOBEC3A的增强型CBE6、基于人激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase)的CBE7和基于七鳃鳗(Petromyzon marinus)胞苷脱氨酶的CBE Target-AID4诱导较少的RNA编辑。

最后,他们发现表现出RNA脱靶编辑活性的CBE和ABE也能够对它们自身的转录本进行自我编辑,从而导致碱基编辑器编码序列出现异质性。(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Julian Grünewald et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6.
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