Bioresource Technology:发表通过理性代谢工程改造谷氨酸棒杆菌结合两阶段pH调控策略高效合成L-谷氨酰胺的研究成果

近期，江南大学生物工程学院饶志明教授团队在L-谷氨酰胺的高效制备方面取得重要进展，研究成果“Enhancing L-glutamine production inCorynebacterium glutamicumby rational metabolic engineering combined with a two-stage pH control strategy”正式发表于Bioresource Technology（IF = 9.642） （https：//doi.org/10.1016/j.biortech.2021.125799）。

L-谷氨酰胺是一种半必需氨基酸，由于其特殊的营养及免疫功能，尤其是对肠胃溃疡和大面积烧伤的治疗具有重要作用，近年来被广泛应用于食品、医药和饲料等领域。目前，L-谷氨酰胺的生产方法主要有发酵法、酶法以及化学合成法。酶法合成L-谷氨酰胺存在操作复杂、产量低及反应过程中需要额外加入大量价格昂贵的ATP等缺陷，而化学法合成L-谷氨酰胺存在着严重的环境污染等问题，因此目前常利用微生物发酵法生产L-谷氨酰胺。然而，缺乏高产量高转化率的食品安全菌株以及发酵工艺的不成熟是限制L-谷氨酰胺工业生产的主要原因。

饶志明教授团队针对上述发酵法生产L-谷氨酰胺过程中存在的产量低、转化率低及工艺不成熟等问题，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，采用代谢工程改造结合两阶段pH调控策略高效制备L-谷氨酰胺。首先，通过ARTP诱变及高通量筛选获得了一株产量为25.7±2.7 g/L的谷氨酸棒杆菌N01。接着，以N01为出发菌株进行一系列的理性代谢工程改造，主要包括：（1）增强前体L-谷氨酸富集池及流向L-谷氨酰胺的碳通量。敲除proB基因，阻断脯氨酸支路竞争途径；敲除谷氨酸机械分泌通道蛋白NCgl1221，降低发酵液中副产物L-谷氨酸含量，同时使更多的前体L-谷氨酸在胞内积累从而促进L-谷氨酰胺的高效合成。（2）提高关键酶谷氨酰胺合成酶（GS）的催化活性。敲除谷氨酰胺合成酶腺苷酰化转移酶GlnE，解除GS的腺苷酰化作用；通过筛选8种不同来源的GS酶，获得了一种酿酒酵母来源的具有高催化活性的GS，并用质粒pXMJ19进行异源过表达。（3）通过引入基于PPK的ATP再生系统增强胞内ATP供应。串联表达大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶ppk，增强胞内ATP再生。（4）利用RBS工程优化串联质粒pXMJ19-glnA-ppk基因表达水平。最后，为解决菌体生长和发酵产酸之间的不平衡，提出了pH分阶段调控策略并优化了pH，从而实现了L-谷氨酰胺产量的大幅度增长。最终的工程菌在5L发酵罐中L-谷氨酰胺的最高产量为73.5±3.1 g/L，糖胺转化率为0.368±0.034 g/g葡萄糖。本研究为已报道的利用谷氨酸棒杆菌生产L-谷氨酰胺的最高产量，为工业生产L-谷氨酰胺及相关的高价值产品提供了一系列有效的策略。(生物谷Bioon.com）