马英新/刘映霞团队合作开发新冠病毒核衣壳蛋白比率荧光免疫分析新方法

截至2022年7月，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）引起的全球性疫情已造成了超过五亿人感染，六百多万的死亡病例。SARS-CoV-2的早期诊断对于新冠疫情的有效防控具有重要意义。SARS-CoV-2检测方法主要分为三类：核酸、抗体和抗原检测。核酸检测具有灵敏度高的优点，但需要昂贵的设备及专业的技术人员进行操作；抗体检测简便、快速、对技术要求较低，但存在窗口期长、灵敏度与准确性有限等不足；相较于上述两种检测方法，抗原检测具有便捷、响应快等优势，更适合SARS-CoV-2感染的快速筛查。然而，常规抗原检测存在灵敏度低、假阴性高等问题。酶联免疫分析（ELISA）因其方法简单、成熟，且技术要求较低等优点广泛应用于抗原检测。相较于比色法ELISA，荧光ELISA具有更宽的动态范围、更高的灵敏度。

在过去的二十多年里，开发用于生物应用的荧光纳米探针一直是纳米生物学领域的研究热点。荧光硅纳米粒子（Si NPs）具有高量子产率、优异的稳定性和低的生物毒性等特点，在生物传感器开发方面有着广泛的应用。然而，基于单发射峰的荧光生物传感器易受环境、探针浓度波动和实验仪器不稳定等因素的干扰。针对这些问题，研究团队构建了一种基于Si-FITC NPs的新型比率荧光探针，结合荧光法ELISA，提高了对SARS-CoV-2核衣壳蛋白检测的灵敏度和重现性。

近日，中科院深圳先进院马英新和南方科技大学第二附属医院刘映霞团队合作，在Nano Research 期刊发表了题为：Ratiometric fluorescence immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein via Si-FITC nanoprobe-based inner filter effect 的研究论文。

在该研究中，马英新和刘映霞团队采用合成前修饰方法制备了新型比率荧光探针Si-FITC NPs，该方法无需合成后化学修饰过程，提高了探针的发光效率和稳定性。Si-FITC NPs的同步荧光光谱中有两个明显的荧光峰，一个是位于381 nm的Si荧光峰，另一个是在489 nm处的FITC荧光峰。碱性磷酸酶（ALP）是一种重要的水解酶，普遍存在于哺乳动物的体液和组织中，它可以通过去磷酸化过程去除核酸、蛋白质等生物分子中的磷酸基团。本研究利用ALP催化对硝基苯基磷酸盐（pNPP）水解为对硝基苯基（pNP）及pNP对比率荧光探针Si-FITC NPs中Si的内滤效应（IFE），实现了对Si-FITC NPs对ALP的特异性猝灭响应。

在本检测体系中，Si-FITC NPs双峰荧光强度比值的变化与ALP活性呈正相关。ALP作为ELISA中广泛使用的标记酶，可以介导用于SARS-CoV-2 N蛋白的检测，且结果显示该检测方法比商品化试剂盒灵敏度高1个数量级。同时，将该新型ELISA方法应用于人血清中SARS-CoV-2 N蛋白检测。在血清回收实验中，其回收率为95.17-107.41%，表明该方法具有一定的应用潜力。

此外，将该方法用于了SARS-CoV-2病毒感染的临床样本分析，结果显示该方法能准确地检测出SARS-CoV-2的阳性样本和阴性样本，可为SARS-CoV-2病毒感染的早期筛查提供有效的方法指导。该方法不仅提高了ELISA的检测灵敏度，而且拓宽了基于内滤效应的比率型传感器的应用范围。

如图1所示，研究团队采用一锅水热法制备比率荧光探针Si-FITC NPs，该方法将APTES与FITC偶联，与APTES共作为Si源，避免了合成后修饰，提升了探针的发光效率与稳定性。在ALP介导的比率荧光ELISA传感体系中，通过形成固定化ALP的免疫复合物，可将SARS-CoV-2 N蛋白含量转化为检测体系内ALP含量。

研究团队使用350 V氙气灯对Si-FITC NPs连续辐射两小时并监测其荧光强度变化以评估Si-FITC NPs的光稳定性（图2A）。结果表明，由于Si涂层的保护，Si-FITC NPs中的Si和FITC都具有更好的光稳定性。Si-FITC NPs在不同的Tris缓冲液pH条件下双峰的荧光强度比没有明显变化（图2B）。团队还研究了体液中一些常见离子和生物分子对Si-FITC NPs荧光的影响（图2C）。这些干扰物质（100 μM）对Si-FITC NPs的荧光基本没有影响，证实Si-FITC NPs具有强的抗干扰能力。以上数据表明Si-FITC NPs具有良好的光稳定性、pH稳定性及化学稳定性。

研究团队考察了ALP对Si-FITC NPs探针特异性猝灭的性能。结果显示，随着ALP浓度从0 U/L增加到200 U/L, Si-FITC NPs在389 nm处的荧光被明显猝灭，而481 nm处的荧光没有明显变化。表明可通过比率荧光的方法检测体系中的ALP浓度（图3A）。当ALP浓度处于0.5–20.0 U/L的范围中时，可以观察到Si-FITC NPs探针的双峰荧光强度比的差值（Δ(F389/F481)）与ALP浓度之间有良好的线性关系（图3B）。ALP作为ELISA中广泛使用的标记酶，在检测体系中可以介导ELISA用于SARS-CoV-2 N蛋白的免疫分析。