Advanced Science：南大/药大团队首次证实，基于红细胞的新型液体活检可用于早期肺癌筛查和诊断

哺乳动物红细胞（RBC）是一类没有细胞核或线粒体的细胞，是氧气、二氧化碳和细胞代谢副产物的运输载体[1]。在哺乳动物红细胞成熟过程中，红系前体细胞在线粒体的辅助下将细胞核排出细胞外，产生无核网织红细胞，网织红细胞成熟后被释放到血液循环中，通过清除线粒体和其他细胞器进一步成熟为红细胞[2-3]。

有文献报道，某些存在脾脏功能缺陷的患者循环红细胞中存在含有DNA的包涵体，这种包涵体被称为Howell-Jolly小体（HJBs），HJBs的形成是红系发育异常过程的结果，大多数HJBs含有着丝粒区DNA，只有少数HJBs的DNA来自常染色质[4-5]。但成熟红细胞是否含有DNA及DNA的种类尚不明确。

近日，南京大学医学院的陈奇涵及中国药科大学生命科学与技术学院梁宏伟团队在Advanced Science上发表了重要研究成果。

他们发现，人类成熟红细胞中含有的长片段DNA在健康人群和肺癌患者间存在显著差异，这也是首次发现基于红细胞的新型液体活检技术可用于早期肺癌筛查和恶性肿瘤诊断[6]。

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既往研究表明，红细胞不仅可以通过自身表面的Toll样受体9（TLR9）与细胞游离mtDNA和致病DNA结合，调节机体免疫功能，还能在肿瘤进展和转移中发挥重要作用[7-8]。

鉴于此，研究团队猜想，红细胞中或许含有来源于肿瘤细胞的物质。

于是，研究团队首先对成熟红细胞中是否含有DNA这一问题进行了研究。从健康供者的新鲜全血中分离出红细胞后，研究团队通过镜下观察和流式细胞术检测了红细胞的纯度，并确认得到的样本中无单核细胞、T细胞掺杂。

接着，研究团队使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对红细胞中的DNA进行染色后发现，红细胞中不仅存在DNA，且DNA充满了整个红细胞内部。当研究团队使用原子力显微镜（AFM）观察红细胞中的DNA时发现，在红细胞DNA中存在多个中位长度为数千bps的DNA片段，且这一现象为成熟红细胞特有。

红细胞DNA的性质和特征

随后，研究团队利用二代测序获得了这些DNA信息，结果发现，超过98.72%的DNA片段来源于人类基因组，且这些DNA片段覆盖了核基因组（平均90.02%）和线粒体基因组（100%）的大部分区域。

研究团队还发现，DNA在红细胞之间分布不均匀，此外，DNA片段在每条染色体上的分布存在一些较明显的缺失。

接着，研究团队进一步探索了不同健康状态下（健康人群、肺部有良性结节的以及有恶性肿瘤的患者）红细胞内DNA的表达情况。

研究共收集了20份新鲜血液样本，其中健康献血者3例，肺良性小结节患者6例，肺癌患者11例。结果发现，健康献血者的红细胞DNA在全基因组中分布非常均匀，而大多数良性结节或癌症患者的红细胞DNA拷贝数存在明显差异，且在多个样品中均观察到多个区域存在缺失。

大多数良性结节或癌症患者的红细胞DNA拷贝数存在明显差异

由于红细胞DNA拷贝数变异（CNV）在不同组别样本中显示出明显差异，研究团队进一步探索了红细胞DNA是否可以被用来筛查肺癌患者。

基于20个样本共筛选出4202个组间CNV差异显著的区域，进行聚类后明显形成了三个组。其中18个样本均在聚类后被准确分组，也就是说，红细胞DNA可以有效区分健康人群、良性结节和肺癌患者。

根据上述实验结果，研究团队认为，在癌症发展的早期，红细胞与癌细胞之间可能发生分子交换（DNA/RNA/蛋白质/其他）。

为了验证这一假设，研究团队将健康人群的红细胞和肺癌细胞系（A549: KRAS G12S突变、H1975: EGFR L858R、T790M突变）进行了体外共培养实验，共分为三组：无癌细胞组、直接接触组和transwell组，并在不同时间点收集分离红细胞，检测EGFR L858R、T790M和KRAS G12S的潜在突变位点。

令人惊讶的是，直接接触组在共培养30s时即能检测到10%的EGFR突变，共培养2-12h后这一比例增加至70%。也就是说，在短暂的直接接触之后，红细胞即获得了对应细胞系的突变DNA片段，而非直接接触组则没有发现这种DNA片段转移。

体外实验中肺癌细胞系DNA通过直接接触转移至红细胞

为了进一步探究这一现象的生理意义，研究团队开展了一项小规模的临床研究，进一步验证癌细胞与红细胞之间的物质交换。研究共分析了26例肺癌患者的组织和红细胞样本，其中21例患者被诊断为I期肺癌，IA期4例，IA2期8例，IA3期3例，IB期6例。

以组织基因突变情况为参考，研究团队对红细胞中提取的DNA进行二代测序，然后尝试在早期的肺癌患者中检测三个最常见的突变位点，最后手术之后的肿瘤组织进行比较。

结果共检测到EGFR 19del突变7例，EGFR L858R突变11例，KRAS G12A突变1例，与肿瘤组织对比后确定为真阳性结果，仅有1例突变率较低的患者（LC44，4% KRAS G12S）被判定为漏检。证明红细胞检测肿瘤来源DNA的灵敏度较高，且在早期肿瘤的筛查中优势显著。

肺结节的良恶性鉴别，尤其是小于1cm的肺结节，一直是困扰临床医生和患者的难题。在所有的新方法中，液体活检可以无创地为结节的病理诊断提供额外的信息。

本研究在红细胞DNA CNV的基础上发现了明显的良性和恶性小结节的差异，首次证实了基于红细胞的新型液体活检技术的重要意义，为未来癌症诊断研究提供了新的方向。

参考文献：

[1] Dzierzak E, Philipsen S. Erythropoiesis: development and differentiation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013;3(4):a011601. Published 2013 Apr 1. doi:10.1101/cshperspect.a011601

[2] Liang R, Menon V, Qiu J, et al. Mitochondrial localization and moderated activity are key to murine erythroid enucleation. Blood Adv. 2021;5(10):2490-2504. doi:10.1182/bloodadvances.2021004259

[3] Chen M, Sandoval H, Wang J. Selective mitochondrial autophagy during erythroid maturation. Autophagy. 2008;4(7):926-928. doi:10.4161/auto.6716

[4] Sears DA, Udden MM. Howell-Jolly bodies: a brief historical review. Am J Med Sci. 2012;343(5):407-409. doi:10.1097/MAJ.0b013e31823020d1

[5] Felka T, Lemke J, Lemke C, Michel S, Liehr T, Claussen U. DNA degradation during maturation of erythrocytes - molecular cytogenetic characterization of Howell-Jolly bodies. Cytogenet Genome Res. 2007;119(1-2):2-8. doi:10.1159/000109611

[6] Liang N, Jiao Z, Zhang C, et al. Mature Red Blood Cells Contain Long DNA Fragments and Could Acquire DNA from Lung Cancer Tissue [published online ahead of print, 2023 Jan 4]. Adv Sci (Weinh). 2023;e2206361. doi:10.1002/advs.202206361

[7] Lam LKM, Murphy S, Kokkinaki D, et al. DNA binding to TLR9 expressed by red blood cells promotes innate immune activation and anemia. Sci Transl Med. 2021;13(616):eabj1008. doi:10.1126/scitranslmed.abj1008

[8] Helwa R, Heller A, Knappskog S, Bauer AS. Tumor cells interact with red blood cells via galectin-4 - a short report. Cell Oncol (Dordr). 2017;40(4):401-409. doi:10.1007/s13402-017-0317-9