Nature Biotechnology | 光与影的魔法：csLFM引领活体成像新时代

该研究中，研究人员提出的共聚焦扫描光场显微镜(confocal scanning light-field microscopy, csLFM)通过综合利用线性共聚焦照明与滚动快门的同步，实现了高保真度、低光毒性的长时间三维活体成像。csLFM在多种实验条件下表现出显著优于传统显微镜技术的性能。

csLFM示意图（Credit: Nature Biotechnology）

背景荧光抑制与信号增强

csLFM通过物理排除离焦荧光，有效提高了信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)，使其能够识别出微小的亚细胞结构。与传统的扫描光场显微镜(scanning light-field microscopy, sLFM)相比，csLFM在数值模拟中实现了12 dB的信号背景比(signal-to-background ratio, SBR)提升，实验验证显示在更深的穿透深度下，csLFM的侧向分辨率(full width at half maximum, FWHM)比sLFM窄三倍。

多物种、多指标成像

csLFM可以应用于不同物种和指标的成像。例如，在表达基因编码钙指示剂(GCaMP6s)的斑马鱼幼体脑部，csLFM能够在高密度神经元群中清晰分辨单个细胞。实验结果显示，csLFM比传统的cLFM和sLFM识别出更多的神经元，并且分辨率和保真度更高。

在果蝇脑部的成像中，csLFM通过减少背景荧光，提高了成像对比度，能够清晰识别出在背景中被淹没的电压信号。通过标记几乎所有多巴胺能神经元，csLFM能够在150 VPS的速度下进行体积电压成像，相比sLFM，csLFM识别出的电压尖峰数量增加了三倍，尖峰幅度增加了1.5倍。

研究人员通过对比csLFM、sLFM和cLFM在相同系统下的表现，验证了csLFM的优越性。实验中采用不同浓度的脂质体和琼脂糖制作的三维组织模拟样品进行成像。结果显示，随着穿透深度的增加，背景荧光逐渐淹没了焦内珠子的强度，而csLFM在不同浓度的脂质体下获得了整体12 dB的SBR提升，穿透深度更深，侧向FWHM比sLFM窄三倍。

在小鼠脾脏的免疫细胞成像实验中，csLFM不仅能够分辨亚细胞结构，还显著提高了SBR，有助于研究免疫细胞间的动态协作行为。在厚达300 μm的Thy1-YFP小鼠脑切片成像中，csLFM清晰分辨了复杂的树突和突触结构，而传统的sLFM难以在强背景荧光下实现如此高的分辨率。

高速神经记录

在小鼠视觉皮层的神经活动记录实验中，csLFM显示出卓越的性能。通过对比sLFM和csLFM在相同视觉刺激下的神经响应，csLFM在减少串扰的同时，提高了神经信号的对比度和保真度。实验结果表明，csLFM记录的神经元数量和尖峰幅度显著高于sLFM，且具有更高的方向选择性指数(orientation selectivity index, OSI)，其分布与双光子显微镜结果相似。

亚细胞动态研究

csLFM在观察小鼠肝脏中的收缩体生成时，同样展示了其优越性能。通过降低激发光强度并提高成像对比度，csLFM能够清晰地可视化血管结构和亚细胞动态。此外，在果蝇的大规模神经记录中，csLFM通过减少串扰，提高了神经活动记录的精度和数据吞吐量，展示了其在高保真度神经记录中的巨大潜力。

csLFM通过优化背景抑制和信号检测，实现了在复杂生物环境中的高保真度、长时间三维成像，显著提升了成像深度、分辨率和数据吞吐量，具有广泛的应用前景。这项研究不仅为活体成像技术的发展提供了新的思路，也为理解多种生理病理过程提供了重要的工具。