类器官你养对了吗？下面几样缺一不可！

类器官 (Organoid) ，也被称为体外三维（3D）组织。始于2009年HansClevers课题组首次在 Nature 期刊报导，使用小鼠肠道成体干细胞成功诱导具有隐窝和绒毛结构的小肠类器官。随着近十年来干细胞体外培养、诱导分化技术的发展，类器官的相关研究也在飞速发展——今天就让T仔来带大家了解一下类器官培养的奥秘~

类器官简介

类器官是由 干细胞 培养而形成的的具有复杂 3D 结构的组织。

尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但其结构与功能与体内器官类似，能够在很大程度上模拟体内组织的结构与功能，并能够长期稳定的传代培养。

▲类器官研究史 [1]

目前，实验室中已经能够成功培养出 小肠、结肠、胃、肺、膀胱、大脑、肝脏、肾脏、胰脏、乳腺、卵巢、前列腺、食道、心脏、视网膜、内耳 等十几种正常或肿瘤组织的类器官模型。

目前类器官主要来源于:胚胎干细胞 (ESC) 、诱导多能干细胞 (IPSC) 和 器官特异性成体干细胞 (ASC) 。

类器官的构建是一项系统工程，需要 特定的物质基础 与 合适的培养环境 互相配合，来精准的调控细胞生长微环境。

物质基础 通常包括干细胞、含有各种生长因子的 3D 培养介质以及促进/抑制分化的小分子化合物。

培养环境 则包括了氧浓度、二氧化碳浓度、温度的调控以及模拟体内细胞生长的力学参数。

培养介质

类器官培养最常见的方式是使用可以粘附细胞并支持细胞生长的固体 细胞外基质 (ECM)。

如由 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤纯化而来的天然 ECM，基质胶 (Matrigel) 。因混有多种天然生长因子，而往往使得细胞具有更好的生长和分化能力，是 3D 类器官衍生中使用最广泛的基质。可用于 肠、脑、胃和乳腺 等多种类器官的培养。

但由于天然生长因子的不确定性，也有化学合成的 水凝胶 (hydrogel) 被开发用于 肠道、大脑 等类器官的培养。

此外，常见的培养方式还有，3D悬浮培养（视杯、大脑、小脑、海马体）、空气-液体界面微孔膜培养（肾脏类器官）等。

▲常见类器官培养介质及其可培养的类器官种类 [2]

生长因子

生长因子是类器官培养的重要组成部分，它们通过调控一系列信号通路来引导干细胞的分化方向，类器官培养中常用的生长因子包括：

◆Wnt3A：细胞发育、增殖、分化、粘附和极性的主要调节者

◆EGF（表皮生长因子）：用于上皮组织，可促进肿瘤生长

◆Noggin（头蛋白）：调节细胞分化、增殖和凋亡

◆R-spondin（Rspo ，R海绵蛋白）：是干细胞自我更新和激活Wnt信号所必须的关键因子

◆Activin A（激活素A）：调控炎症、纤维化和肿瘤发生

◆FGF-10（纤维母细胞生长因子10）：对器官发育很重要，促进迁移和肿瘤发生

◆FGF-7（纤维母细胞生长因子7）：促进肿瘤生长、侵袭和迁移

◆HGF（干细胞生长因子）：促进肿瘤发生、肿瘤血管生成和侵袭

▲类器官培养添加成分 [3]

注：均含基础培养基补充成分：Glutamax、HEPES、B27、N2、N-acetylcysteine。上标数字为加入该生长因子/小分子化合物对应的类器官生长阶段：0为各阶段均添加；1，2，3分别为生长、扩增、分化阶段。

除了生长因子外，还有种类众多的 小分子化合物 也在类器官培养中起到了重要的作用~

小分子化合物 是指分子量小于1000 Da，具有生物学活性的化合物。

与细胞因子和蛋白不同，小分子化合物可以透过细胞膜进入细胞，发挥相应的生物学功能。小分子化合物的作用靶点众多，已广泛应用于干细胞、类器官、免疫学、神经生物学、表观遗传学、细胞凋亡、离子通道、肿瘤学和信号转导等生命科学中诸多重要的研究领域。

作为小分子化合物专家，TargetMol® 能为科研伙伴们全方位提供各种类器官培养相关的小分子化合物！只有你想不到，没有你买不到~

Gastrin（胃泌素）：一种非常重要的多肽类激素。胃泌素与胆囊收缩素B受体 (CCKBR) 结合，提高细胞内 Ca2+、促进磷酸肌醇的生成和蛋白激酶 C 的激活。胃泌素还参与胃上皮细胞的增殖和分化，常用于胃肠道类器官的研究，并在肠道及肝脏类器官培养中用于延长类器官的存活时间。

Nicotinamide（烟酰胺）：是一种 B3 维生素，参与多种酶促氧化还原反应，是类器官长期培养所需的营养素，可用于胃肠道、肝脏以及乳腺类器官的培养。烟酰胺与细胞因子、其他生化试剂一起能发挥抗炎特性，并促进间充质干细胞分化成胰岛素生成细胞，抑制 Sirtuins 活性，以促进类器官的形成和延长类器官的寿命。

A-83-01：Activin/NODAL/TGF-β 通路抑制剂，抑制 ALK5/4/7 激酶活性，一般用于肝脏、前列腺以及乳腺类器官的培养，常被用于抑制 iPSCs 的分化，维持体外细胞的自我更新，延长类器官体外培养时间。

SB202190：高效的 p38 MAPK 激酶抑制剂，靶向作用 p38α/β，抑制癌细胞增殖和迁移。SB202190 可诱导人胚胎干细胞向心肌细胞分化，促进神经干细胞的自我更新，可用于胃肠道、乳腺类器官的培养。 

Y-27632：强效的 ATP 竞争性 ROCK 抑制剂，ROCK-I:220 nM(ki), ROCK-II:300 nM(ki)， 也抑制 PRK2 (IC50=600 nM)。通过上皮-间充质过度引发人诱导多能干细胞选择性地分化为间胚层谱系。一般在种板培养的第一次加入，后续换液培养可不添加。Y-27632 (10µM) 处理人胚胎干细胞 1h，可抑制干细胞的凋亡，提高克隆效率，延长细胞的传代。

DBZ（二苯并氮卓）：阻断 Notch 激活，抑制类器官的分化和分层。

DAPT：抑制Notch 1信号传导并诱导细胞分化，还可诱导细胞自噬和凋亡。

CHIR-99021：GSK-3 (GSK3α/β) 抑制剂，可诱导人胚胎干细胞向内胚层分化，多用于肾脏和视网膜类器官培养。作为 Wnt/β-catenin 信号通路激活剂，能诱导细胞自噬，增强小鼠和人类胚胎干细胞的自我更新。 

RA（维生素A酸）：维生素 A 的代谢产物，能结合并激活视黄酸受体，诱导基因表达的变化，导致细胞分化、细胞增殖减少和肿瘤发生的抑制。

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作为一门新兴的技术，类器官在许多领域都有着巨大的应用潜力，包括 发育生物学、疾病建模、精准医学、再生医学、毒理学、药物发现研究、宿主-微生物组相互作用、基因编辑、多组学和系统发育研究 。

类器官的培养是对现有 2D 培养方法和动物模型系统的互补，为人体发育的研究提供了不受伦理限制的平台，也为药物筛选提供了新的平台。

 ▲类器官应用 [1]

所以说：

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参考文献：

[1] Corrò C, Novellasdemunt L, Li VSW. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 2020 Jul 1;319(1):C151-C165. doi: 10.1152/ajpcell.00120.2020. Epub 2020 May 27. PMID: 32459504; PMCID: PMC7468890.

[2] Rossi G, Manfrin A, Lutolf MP. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 2018;19(11):671-687. doi:10.1038/s41576-018-0051-9

[3] LI Tian-Rui,ZHAO Rui-Bo,ZHANG Quan,et al.Progress in The Research of Organoids and Applications[J].Progress in Biochemistry and Biophysics,2019,46(08):737-750.

[4] Sato, T. et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262–265 (2009).