Mol Cell：施一公团队解析人类pre-tRNA剪接机制，完善剪接体结构地图

长久以来，剪接体的调控机理是怎样的，它们在细胞内部的动态组合和变化是怎样的，深深地吸引着科学家们的研究兴趣，但其神秘的面纱一直未被揭开。

2023年4月6日，西湖大学施一公团队在 Molecular Cell 期刊发表了题为：Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease 的研究论文。

该研究首次解析了人类tRNA剪接内切核酸酶（TSEN）在催化前和催化后状态下与全长tRNA前体（pre-tRNA）结合的低温电子显微镜结构，显示了TSEN如何识别pre-tRNA，并将3'剪接位点和5'剪接位点定位到其切割位点，综合利用结构生物学和生化工作解释了人类TSEN去除pre-tRNA内含子的分子机制。

转运RNA（tRNA）对生物遗传信息的传递至关重要，它通过核糖体将mRNA翻译成蛋白质。成熟的tRNAs由前体tRNAs（pre-tRNAs）通过一系列的转录后加工和修饰步骤产生，从pre-tRNA中去除内含子对于生物遗传进化是必不可少的。

在人类中，去除pre-tRNA中内含子的过程是由tRNA剪接内切核酸酶（TSEN）介导的，该亚酶包括四个亚基：TSEN2、TSEN15、TSEN34 和 TSEN54。值得一提的是，尽管多核苷酸激酶CLP1在体外对前tRNA切割是可有可无的，但CLP1中的突变和所有TSEN亚基都与tRNA代谢和神经病理学的改变有关。

为回答pre-tRNA是如何被TSEN识别的，以及5'剪接位点和3'剪接位点是如何被加载到TSEN2/TSEN34的活性位点这两个困扰科研界多年的谜题，该研究通过纯化人TSEN/CLP1复合物、pre-tRNA切割试验、TSEN/CLP1/前pre-tRNA复合体的组装、冷冻电镜样品制备和数据采集以及竞争性结合测定生化实验，对其进行深入探索。

本研究首次报道了两种人类TSEN与全长pre-tRNA结合、高分辨率低温电子显微镜结构：一种在催化前状态，另一种在催化后状态，平均分辨率分别高达2.94Å和2.88Å。

研究结果显示人类TSEN的结构特征是一个延伸的表面凹槽，容纳了l形的pre-tRNA，pre-tRNA的成熟结构域被TSEN34、TSEN54和TSEN2的保守结构元件所识别，这种识别定位了pre-tRNA的反密码子茎。

令人惊喜的是，5'剪接位点和3'剪接位点周围的核苷酸主要被TSEN2和TSEN34识别，这些相互作用可以确保5'剪接位点和3'剪接位点分别精确地放置在TSEN2和TSEN34的催化中心中。

此外，为了捕获预催化状态，研究人员在TSEN中引入了两个错义突变：TSEN34中的H255A和TSNE2中的H377A，进而研究其结构信息以及结构引导的生化分析，为成功解析人类TSEN前tRNA识别和切割的机制提供了基础。

考虑到pre-tRNA和tRNA结构的相似性，TSEN延伸的扩展表面凹槽也应该识别tRNA。为证实该分析，tRNAARG-UCU与TSEN/CLP1形成了一个稳定的复合物。与tRNA相比，pre-tRNA可以被TSEN识别，其更具体的相互作用指向其独特的BHL基序。

上述结果充分地解释了为什么大部分的内含子序列与TSEN没有直接的相互作用，而不同内含子的pre-tRNA可以被容纳和裂解，解析了人类TSEN去除pre-tRNA内含子的分子机制。

值得一提的是，施一公及张晓峰团队于两个月前发表的研究论文：Mechanisms of the RNA helicases DDX42 and DDX46 in human U2 snRNP assembly，揭秘三种RNA解旋酶作用机制——人U2 snRNP组装中RNA解旋酶DDX42和DDX46的作用机制，为癌症突变机制提供新见解。

施一公院士团队是世界上首个、也是唯一一个成功捕获并解析了RNA剪接过程中所有完全组装剪接体高分辨率三维结构系列成果的团队。从组装到被激活，从两步转酯反应发生到剪接体的解聚，各种各样状态的剪接体完整覆盖了剪接通路，首次将剪接体介导的RNA剪接过程完整地串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息，成功获取剪接体这颗分子生物学皇冠上的明珠。

图 5：剪接体结构汇总（来源：https://ygshi.org/research）

目前，施一公团队克服技术障碍，深入探索生命细节，获得人类TSEN/CLP1/pretRNA复合物在催化前和催化后状态下的结构，为理解pre-tRNA剪接的机制提供了一个全新的框架。如此振奋人心的研究结果令人看到了科学家们孜孜不倦的努力，从基础科学的研究到临床应用，再到治疗疾病，未来可期。