Circulation | 上海交通大学张冰/张岩/孙琨发现肥厚型心肌病的潜在治疗新策略

大多数MYH7 致病性变异位于肌凝蛋白头部，这增加了肌动球蛋白的相互作用，导致过度收缩和疾病进展头部区域的序列变异，如MYH7 p.R403Q，一种被充分研究的点突变，与心脏事件的高发生率和更恶性的预后相关位于杆状结构域的致病变异，如c.2609G>A (p.R870H)也有报道，但缺乏调查。p.R870H在0.26%的HCM患者中被鉴定出来，导致轻度HCM，在成人中疾病外显率约为50% MYH7 p.R870H在儿童期发病的HCM中也有报道，与成人发病的HCM相比，儿童发病的HCM表现出更严重的肥厚表型。与其他MYH7变异的复合杂合序列变异可能解释了MYH7 p.R870H的表型异质性，但在人类和动物遗传研究中仍未被探索。

基因治疗最近已成为动物模型中治疗MYH7 HCM的一种令人信服的方法。使用RNA干扰选择性抑制MYH7错义序列变异等位基因对HCM的预防有实质性的影响。然而，实现等位基因特异性敲除需要致病SNV附近的单核苷酸多态性(SNP)，这限制了该策略的使用。最近，在转基因小鼠中，使用碱基编辑器纠正基因组SNV也有效地阻止了MYH7引起的HCM然而，由于原间隔邻近基序序列的限制和有限的编辑窗口，许多SNV无法有效靶向。此外，经过良好测试的碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器，它们只允许A:T到G:C和C:G到T:A的转换。因此，近30%的SNV需要其他类型的转换是无法编辑的。此外，其固有的旁观者毒性和基因组脱靶风险进一步限制了其在体内基因治疗中的应用。

高精度Cas13d的结构定向进化（Credit: Circulation）

到目前为止，已经描述了4个Cas13酶家族(Cas13a至Cas13d)及其相应的CRISPR RNA (crRNA)阵列由于其高RNA切割活性和与DNA编辑器相比明显更高的安全性，CRISPR-Cas13最近被用于开发潜在的疾病治疗方法。与DNA CRISPR核酸酶不同，许多Cas13核酸酶没有原间隔基序相邻基序或原间隔基序侧翼位点，因此应该能够靶向任何RNA序列。Cas13d是结构最紧凑的Cas13(约930个氨基酸)，具有很高的RNA核酸酶活性，特别是对于最近发现的变体黄瘤球菌XPD3002 Cas13d (RfxCas13d)。然而，目前尚不清楚Cas13d是否可以等位切割MYH7致病性转录本，这与野生型(WT)转录本存在单个核苷酸的差异。这种能力是Cas13d治疗MYH7引起的HCM所必需的。

该研究首先建立了SNV等位基因鉴别报告系统。通过筛选针对人类MYH7 p.R870H和p.R403Q类似变体(小鼠Myh6 p.R872H和p.R404Q)的向导RNAs (gRNAs)，证明WT RfxCas13d缺乏区分WT Myh6 RNA变体的能力。Cas13d的合理进化产生了一个高精度的Cas13d变体hpCas13d，它精确有效地切割Myh6变体，同时保留了Myh6的WT。

将hpCas13d应用于2种不同遗传HCM小鼠模型(Myh6R872H/+和Myh6R872H/R404Q)。体内实验表明，它能准确、选择性地抑制Myh6 RNA错义变异体，防止肥厚表型。将hpCas13d传递到发育的肥厚心脏中也表现出拯救作用。大规模筛选表明，hpCas13d从MYH7 WT中区分出各种MYH7致病变异，包括碱基编辑无法获得的SNV。该研究证明了RNA核酸酶在治疗遗传性心脏病方面的巨大潜力，并为HCM患者提供了具有转化前景的药物。