Nature Biotechnology：抗体工程师的“强迫症”福音——让细胞自己做纯化，这波操作太巧妙了！

十选一的豪赌：双抗生产为何如此“糟心”？

要理解这项新技术的巧妙之处，我们先来深入体会下双特异性抗体生产过程中的“灾难性”混乱。

一个标准的IgG抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链构成，组装过程相对简单。而一个IgG样式的双特异性抗体，我们称之为bsIgG，则拥有两个不同的抗原结合臂 (Fab)，分别由重链1 (HC1) + 轻链1 (LC1) 和重链2 (HC2) + 轻链2 (LC2) 构成。这两条不同的重链再通过其Fc区域配对，形成一个完整的Y形结构。

当编码这四条链的基因被一同送入工程细胞（例如CHO细胞）进行表达时，细胞内的蛋白质合成与组装机器就开始了工作。问题在于，这些机器并没有一个精确的“装配图”。

首先是重链与重链的配对。理论上，HC1和HC2应该配对形成一个异源二聚体 (heterodimer)。但它们也可能自说自话，HC1与另一个HC1配对，HC2与另一个HC2配对，形成两种我们不想要的同源二聚体 (homodimer)。为了解决这个问题，研究界开发出了著名的“旋钮入孔”(Knobs-into-holes, KIH) 技术及其他多种Fc端改造策略。通过在两条重链的接触面上引入空间互补的突变（一个“旋钮”突变，一个“孔”突变），可以极大地促进异源二聚体的形成，成功率相当高。

然而，这仅仅解决了万里长征的第一步。一个更棘手的问题在于重链与轻链的配对。HC1本应只与LC1结合，HC2也应只与LC2结合。但在细胞这个复杂的环境里，LC1可能会错误地与HC2结合，LC2也可能与HC1“私奔”。这种错配 (mispairing) 会产生功能异常甚至完全没有活性的抗体，更糟糕的是，它们还会与正确配对的抗体竞争重链，进一步降低目标产物的得率。

将这两个随机过程叠加起来，情况就变得非常复杂。正确的“HC1-HC2”异源二聚体，可能会错误地搭配上两条LC1、两条LC2，或者一条LC1和一条LC2。而不想要的“HC1-HC1”同源二聚体，也可能去抢夺LC1。最终，在细胞分泌到培养基里的蛋白质混合物中，我们真正想要的那一款完美组装的bsIgG，可能只占不到10%。其余90%以上都是结构相似、性质相近的“残次品”。用传统的层析纯化方法分离它们，效率低下且成本高昂，这使得双特异性抗体，尤其是bsIgG的早期筛选和后期开发都困难重重。

反其道而行之：从“强制配对”到“主动设卡”

面对这一困局，过去的研究思路主要集中在如何“加强”正确配对。比如通过在正确的HC和LC的界面上引入电荷互补或独特的相互作用，来提高它们结合的特异性，比如著名的CrossMAb技术。这些方法虽然有效，但往往需要针对每一对抗体进行个性化的设计和优化，通用性有限。

而该研究团队则提出了一个全新的、更具普适性的解题思路：我们为什么不换个角度，利用细胞本身的机制来解决这个问题呢？

细胞内有一个至关重要的细胞器，内质网 (Endoplasmic Reticulum, ER)。它是蛋白质合成、折叠和组装的主要车间。为了确保分泌到细胞外的蛋白质都是结构正确、功能正常的“合格产品”，内质网拥有一套非常严格的“质量控制”(Quality Control, QC) 系统。这个系统里最重要的“质检员”之一，就是伴侣蛋白 (chaperone protein)，其中最具代表性的是免疫球蛋白结合蛋白 (Binding immunoglobulin protein, BiP)。

BiP的工作职责非常明确：它会在内质网里四处巡逻，一旦发现没有正确折叠的蛋白质，就会立刻上前“抱住”它，阻止它离开内质网。只有当这个蛋白质完成了正确的折叠和组装，BiP才会松手放行，允许它进入后续的分泌途径。

抗体的组装过程就深受这个系统的调控。研究早已发现，抗体的重链自身并不能很好地折叠，尤其是其包含可变区和第一个恒定区 (CH1) 的Fab部分。新合成的重链会迅速被BiP抓住，处于一种未折叠的被扣押状态。此时，它的“天命伴侣”，正确的轻链，出现了。轻链与重链的CH1结构域结合，这个结合事件就像一把钥匙插入锁芯，会诱导重链的CH1结构域发生正确的折叠。折叠完成后，BiP识别的未折叠区域消失，于是它便松开手。至此，一个正确组装的Fab臂才算完成，并获得了离开内质网的“通行证”。

研究人员敏锐地意识到，这个“由轻链诱导的重链折叠 (LC-induced HC folding)”过程，正是大自然赋予的一个完美的控制点。如果，我们能人为地将这个控制点上的“锁”变得更难打开，再给正确的轻链配上一把“万能钥匙”，会发生什么？

ProAla的“双刃剑”：一步“自毁”，一步“拯救”

基于上述情况，研究人员设计出了一种巧妙的分子改造策略，他们称之为 ProAla。这个名字来源于其核心操作：将一个关键的脯氨酸 (Proline, Pro) 突变成丙氨酸 (Alanine, Ala)。这个看似微小的改动，却同时扮演了“自毁”和“拯救”的双重角色。

第一步：人为制造“折叠缺陷”，主动“设卡”

蛋白质的折叠是一个熵减的、需要克服能量壁垒的过程。脯氨酸是一个非常特殊的氨基酸，它的侧链形成了一个环，限制了肽链的柔性。更重要的是，脯氨酸前面的肽键可以在两种构象——顺式 (cis) 和反式 (trans) 之间缓慢转换，这一过程往往是整个蛋白质折叠的限速步骤。

研究人员发现，在抗体重链的CH1结构域的第151位（P151）以及CH3结构域的第374位（P374），都存在一个高度保守的、对折叠至关重要的脯氨酸。他们大胆地将这个脯氨酸突变成了丙氨酸 (P151A / P374A)。丙氨酸的结构简单，无法实现脯氨酸那样的顺反异构。这一改变，极大地提高了该区域的折叠能垒，相当于人为地给这条肽链制造了一个严重的“先天性折叠缺陷”。

这个“缺陷”有多严重？研究人员通过圆二色谱 (Circular Dichroism, CD) 技术检测了突变蛋白的二级结构。CD谱图显示，天然的CH1结构域本身就具有很多无规卷曲，结构并不稳定，而引入P151A突变后，其无规卷曲的比例进一步增加，变得更加“松散”。对于结构更为稳定的CH3结构域，天然状态下呈现典型的β-折叠片层结构，而引入P374A突变后，其β-折叠含量显著下降。这有力地证明了ProAla突变确实破坏了蛋白结构域的自身折叠能力。

这样一来，携带ProAla突变的重链，无论是单独存在，还是与错误的轻链/重链结合，都无法获得足够的能量来克服这个巨大的折叠障碍。因此，它们将永远处于一种“未折叠”的状态，被内质网的“质检员”BiP牢牢地扣押住，无法被分泌出去。一个坚固的“关卡”就这样被设立了。

第二步：设计“专属通行证”，精准“拯救”

仅仅“设卡”是不够的，我们还需要为正确组装的抗体提供一张“专属通行证”。这张通行证，就是通过界面工程改造带来的额外结合能。

研究人员在正确的重链-轻链配对以及重链-重链配对的界面上，引入了额外的、能够增强相互作用的互补性突变。

对于HC-LC配对：以该研究中的bsIgG-7设计为例，研究人员在HC1的CH1区域引入了带正电的赖氨酸突变 (L145K)，同时在LC1的CL区域引入了带负电的天冬氨酸突变 (S131D)，利用电荷吸引力增强这对“官配”的亲和力。而在另一对抗体臂上，他们也做了类似的设计。

对于HC-HC配对：他们将ProAla突变 (P374A) 与经典的“旋钮入孔”或电荷互补技术相结合。比如，在一个重链的CH3上引入正电荷 (L368K/F405K)，在另一个上引入负电荷 (S364D/K409D)。

现在，整个逻辑链条变得清晰起来：当携带ProAla突变的重链HC1遇到了它正确的伴侣LC1时，由于界面工程带来的强大亲和力，二者结合时释放出的能量，足以补偿ProAla突变造成的折叠能量损失，从而“强行”将CH1结构域推过折叠能垒，使其正确折叠。同样，当两条经过工程改造的重链HC1和HC2相遇时，它们之间的相互作用也提供了足够的能量，驱动携带P374A突变的CH3结构域完成折叠。

只有当所有的部件（HC1, LC1, HC2, LC2）都以正确的方式组装在一起时，整个bsIgG分子才能完全折叠成天然构象，摆脱所有BiP的束缚，最终获得“通行证”，被顺利分泌到细胞外。任何一种错配或未组装的单链，都会因为折叠缺陷而被BiP扣押在内质网，最终可能被降解。通过这一系列“设卡-拯救”的巧妙操作，细胞这个原本混乱的工厂，摇身一变，成了一个高度智能的“纯化车间”，它只会将100%正确组装的“正品”送到我们手中。

眼见为实：当细胞开始“无情”地自我纯化

接下来，研究人员进行了一系列严谨的实验，验证了ProAla策略的有效性和其背后的机制。

ProAla策略的惊人纯度

他们首先检验了ProAla策略在bsIgG生产中的实际效果。结果令人振奋：采用全套ProAla设计的bsIgG-7，未经任何纯化，其细胞培养上清液中的抗体，通过体积排阻色谱 (Size-Exclusion Chromatography, SEC) 分析，单体纯度高达96%。此外，通过液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 对其组分进行精确分析，目标bsIgG的比例超过了98%！这意味着细胞几乎只分泌了我们想要的那一种分子。

为了证明ProAla在促进重链异源二聚化方面的优越性，研究人员做了一项非常直观的对比实验。他们设置了不同的重链质粒转染比例（从4:1到1:4），来模拟细胞内两条重链表达水平不均衡的常见情况。通过SDS-PAGE凝胶电泳观察分泌的产物：对于仅使用电荷排斥技术（未加ProAla突变）的对照组，只有在两条重链表达水平接近1:1时，异源二聚体的比例才较高。一旦比例失衡，我们就能清晰地看到大量不想要的同源二聚体。而对于ProAla组（电荷排斥 + P374A突变），无论两条重链的表达比例如何失衡，最终分泌到培养基里的几乎只有一种产物：清晰、纯净的异源二聚体条带！质谱分析确认，其目标产物的纯度在绝大多数比例下都超过99%。

这一结果有力地证明了ProAla系统强大的稳健性，它不再要求研究人员去费力地调整各个组分的表达量，极大地简化了实验操作。

“质检员”BiP的铁证

ProAla策略的核心机制是利用BiP扣押未折叠的蛋白。为了证实这一点，研究人员进行了一项关键的免疫共沉淀 (Co-immunoprecipitation, Co-IP) 实验。他们给重链都加上了一个小标签 (FLAG-tag)，这样就可以用特异性抗体把细胞内的所有重链都“抓”出来，然后检测有多少BiP蛋白跟着一起被“抓”了出来。结果发现，当单独表达携带ProAla突变的半抗体时，这些半抗体在细胞内大量积累，并且与大量的BiP蛋白紧密结合。与此同时，细胞外几乎检测不到这些半抗体的分泌。作为对比，单独表达使用传统KIH技术的半抗体时，它们与BiP的结合要弱得多，并且有相当一部分被“泄漏”分泌到了细胞外。这个实验如同一场“现场抓捕”，直接证明了ProAla突变的肽链确实因为无法正确折叠而被BiP扣押在内质网，从而阻止了“残次品”的外流。

最终产品的“质量检测报告”

一个成功的技术，不仅要保证纯度，更要保证最终产品的功能完好无损。研究人员对ProAla bsIgG进行了全方位的“质量检测”：

在结构方面，他们成功解析了ProAla Fab和ProAla Fc的X射线晶体结构。结果显示，其整体三维结构与天然抗体几乎一模一样。Fab部分的结构与天然Fab的均方根偏差 (r.m.s.d) 仅为0.95 Å，Fc部分也高度相似。这说明ProAla抗体最终折叠成了正确的构象。

在功能方面，他们构建了一款靶向CD3和HER2的ProAla bsIgG，并与通过传统方法生产的相同抗体进行了功能对比。无论是与T细胞的结合能力，还是与HER2阳性肿瘤细胞的结合能力，二者都表现出几乎相同的活性。在最关键的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤实验中，ProAla bsIgG的细胞毒性与对照抗体完全一致。

在成药性方面，研究人员还评估了其稳定性与药代动力学特性。虽然其热稳定性略低于天然抗体，但它在100 mg/mL的高浓度下依然能保持极好的稳定性。在小鼠体内的药代动力学实验显示，其半衰期（约10.5天）与传统的KIH bsIgG（约12.9天）也处于同一水平。

ProAla技术不仅能生产出超高纯度的双特异性抗体，而且这些抗体在结构、功能和基本的成药性上，都与通过传统复杂工艺获得的产品别无二致。

一扇通往新世界的大门？

ProAla技术的意义，远不止于为双特异性抗体的生产提供了一个更优的解决方案。它所蕴含的设计哲学，为整个蛋白质工程领域都带来了深刻的启示。

ProAla并非仅仅是一两个氨基酸的突变，而是一种可被广泛应用的设计原则：通过主动引入一个巨大的折叠能垒来阻止非特异性组装，再通过设计高亲和力的特异性相互作用来提供克服该能垒的能量，从而实现由正确组装驱动的蛋白质折叠与分泌。

这一“折叠介导的分泌 (Folding-mediated secretion)”逻辑，具备推广到其他复杂多亚基蛋白体系的巨大潜力。无论是多链条的激素、复杂的酶复合体，还是其他需要精确组装才能发挥功能的蛋白质机器，都有可能借鉴ProAla的思路，将生产和纯化的难题交由细胞自己解决。

对于药物研发而言，ProAla的价值更是不可估量。双特异性抗体之所以潜力巨大，正是因为其组合的无限可能性。然而，传统的生产瓶颈使得大规模、高通量的bsIgG筛选变得异常困难。而ProAla技术则彻底改变了游戏规则。研究人员现在可以轻松地在一次实验中平行表达上百种不同的ProAla bsIgG，然后直接取细胞上清液进行活性测试，因为他们知道上清液里的几乎都是纯净的目标产物。这将极大地加速新型、高效双特异性抗体药物的发现进程。

从更宏观的视角看，这项工作是人类智慧与自然法则和谐共舞的典范。它没有选择用蛮力去对抗细胞内的随机性，而是深刻理解并巧妙地“驾驭”了细胞亿万年进化而来的质量控制系统。这是一种从纯粹的体外工程向更高维度的“细胞内工程”的范式转变。在未来，我们或许能“教会”细胞做更多更复杂的事情，让这个微小的生命单元，成为我们手中最高效、最精密的生物制造工厂。