张元豪团队使用CRISPR-CATCH技术，实现对ecDNA的靶向分析

早在上世纪六七十年代，科学家们就发现了癌细胞中存在一类微小染色体，之后发现这些没有中心粒和端粒的DNA元件是环形的，大小为几个Mb。

直到2013年，Paul Mischel 教授在 Science 期刊发表论文【1】，指出染色体外DNA（Extrachromosomal DNA，ecDNA）与癌症及靶向治疗耐药性密切相关。此后，ecDNA开始受到广泛关注。

随着测序技术和生物信息学技术的进步，我们现在知道，ecDNA是一种肿瘤特异性DNA元件，呈环形，大小约为1-4Mb。它们在癌细胞中普遍存在，而在正常细胞中很少检测到，这也表明ecDNA的存在是某些癌症的特征。

近年来的研究显示，ecDNA与癌症密切相关，它们能够促进促进染色质可及性，促进癌基因扩增，驱动遗传异质性，促进癌细胞逃逸免疫监视，与多种癌症不良预后有关。因此，ecDNA具有作为癌症检测标志和治疗靶点的巨大潜力。然而，由于ecDNA的巨大尺寸和序列复杂性，对其靶向克隆和分析仍然存在挑战性。

2022年10月17日，斯坦福大学张元豪教授团队在 Nature Genetics 期刊发表了题为：Targeted profiling of human extrachromosomal DNA by CRISPR-CATCH 的研究论文【2】。

该研究使用基于CRISPR-Cas9的染色体片段靶向技术——CRISPR-CATCH，实现了对百万碱基对级别的人类染色体外DNA（ecDNA）的靶向克隆和分析。

染色体外DNA（ecDNA）是一种常见的癌基因扩增模式，与癌症及靶向治疗耐药性密切相关，由于ecDNA的巨大尺寸和序列复杂性，对其靶向克隆和分析仍然存在挑战性。

可通过显微成像观测到ecDNA

2015年，清华大学朱听团队在 Nature Commnications 期刊发表了题为：Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments CATCH enables one-step targeted cloning of large gene clusters 的研究论文【3】。

该研究开发了一种基于CRISPR-Cas9的染色体片段靶向技术——CRISPR-CATCH，并首次使用该技术实现了对上百Kb的基因组片段的靶向克隆，该技术极大地简化了对能够表达具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步骤，可节省时间并降低成本。

在这项 Nature Genetics 研究中，研究团队使用 CRISPR-CATCH 技术成功靶向克隆人类百万碱基对（MB）级的染色体外DNA（ecDNA）。

通过 CRISPR-CATCH 靶向克隆人类ecDNA后的分析，研究团队证实了人类癌细胞中癌基因 EGFR、FGFR2、MYC 在ecDNA中强烈富集，而在获得性耐药的人转移性黑色素瘤细胞中，癌基因 NRAS 在ecDNA中强烈富集。通过比较染色体DNA和靶向富集的ecDNA，研究团队还发现 EGFRvIII 突变只出现在ecDNA中。

研究团队使用CRISPR-CATCH靶向克隆并分离ecDNA后，通过纳米孔测序，使单分子ecDNA的甲基化分析成为可能，并揭示了ecDNA上EGFR启动子的低甲基化特征。研究团队在碱基分辨率层面对同一样本内的异质ecDNA进行区分，发现了具有功能特化的ecDNA，它们能够选择性扩增特定的增强子或癌基因编码序列。

总的来说，该研究使用CRISPR-CATCH对ecDNA进行靶向分析，可以深入了解ecDNA的结构、多样性、起源和表观基因组景观，有助于阐明ecDNA中的致癌基因扩增在癌细胞中是如何被调节的。