Science：施一公团队解析出非洲爪蟾核孔复合体的细胞质环结构

核孔复合体（nuclear pore complex, NPC）位于核膜（NE）上，介导细胞核-细胞质货物运输。作为细胞中最大的分子机器之一，脊椎动物NPC由细胞质丝（cytoplasmic filament）、细胞质环（cytoplasmic ring, CR）、内环（inner ring）、核环（nuclear ring）、核篮（nuclear basket）和管状环（luminal ring）组成。每个NPC有八个重复的亚基。NPC的结构测定是了解其功能机制的先决条件。在过去的二十年里，综合建模，即把核孔蛋白（nucleoporin, Nup）和亚复合物的X射线结构与低温电子断层扫描重建相结合，在推进人们对NPC的认识方面发挥了关键作用。

CR一直是结构研究的一个主要焦点。人类NPC的CR亚基通过低温电子断层成像技术进行子断层扫描图平均化（subtomogram averaging）而得到重建，其整体分辨率为约20埃，局部分辨率为约15埃。每个CR亚基包括两个Y型多组分复合体，称为内侧Y复合体和外侧Y复合体。八个内侧和八个外侧的Y复合体以头到尾的方式组合在一起，分别形成近端和远端环，构成了CR支架。为了实现更高的CR分辨率，来自中国西湖大学的施一公课题组在一项新的研究中使用单颗粒低温电镜（cryo-EM）对来自非洲爪蟾卵母细胞核膜的完整NPC进行成像。对非洲爪蟾CR亚基的核心区域和Nup358区域的重建达到了5～8埃的平均分辨率，从而可以识别二级结构元件。相关研究结果发表在2022年6月10日的Science期刊上，论文标题为“Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex”。

以前所有的电镜图都不能很好地确定CR亚基各组分之间的堆积相互作用。5～8埃的电镜图强烈地提示着了CR亚基存在其他组分，但仍有待确定。解决这些问题需要提高低温电镜重建的分辨率。因此，这些作者可能需要改善样品制备，优化图像采集，并开发一种有效的数据处理策略。

为了减少样品的构象异质性，这些作者用最小的力将打开的核膜铺到网格上，并使用化学交联剂戊二醛来稳定NPC。为了减轻NPC的方向偏差，他们让样品网格发生倾斜，并在较高的角度用较高的电子剂量对样品进行成像。他们改进了图像处理流程。通过这些努力，CR亚基的核心区域和Nup358区域的平均分辨率分别提高到3.7埃和4.7埃。此外，Nup358的N末端α-螺旋结构域的低温电镜结构达到3.0埃的分辨率。这些电镜图允许在每个CR亚基中识别5个Nup358拷贝、2个Nup93拷贝、2个Nup205拷贝和2个Y复合体。依靠这些电镜图并在AlphaFold预测的帮助下，他们为非洲爪蟾NPC的CR亚基生成了一个最终模型。他们的CR亚基模型包括30个Nup的19037个氨基酸。

非洲爪蟾NPC双层CR的低温电镜结构。图片来自Science, 2022, doi:10.1126/science.abl8280。

这些作者发现Nup160的一个以前未知的C末端片段构成了一个顶点（vertex）的关键部分，Y复合体的短臂、长臂和茎部在个顶点相遇。Nup160的C末端片段直接与β推进蛋白Seh1和Sec13结合。两个彼此不接触的Nup205分子通过不同的界面与内侧和内侧的Y复合体结合。两个Nup205分子的构象弹性可能是它们与近端和远端CR环中不同Nup结合的多样性的基础。两个Nup93分子，每个都包括一个N端延伸螺旋和一个ACE1结构域，连接内侧和内侧的Y复合体和Nup205。Nup93和Nup205一起在介导相邻的CR亚基之间的接触中发挥了关键作用。五个Nup358分子，呈虾尾形状，被命名为“钳子（clamp）”，夹住这两个Y复合体的茎部。这种先天的构象弹性使每个Nup358钳子能够适应不同的局部环境，以实现与相邻Nup的最佳相互作用。在每个CR亚基中，α螺旋状的Nup似乎提供了构象弹性；12个β推进蛋白可能加强了CR支架的作用。

综上所述，这些作者构建出的基于电镜图的非洲爪蟾CR亚基模型比已报道的脊椎动物CR亚基的复合模型大大扩展了分子质量。除了这两个Y复合体外，五个Nup358、两个Nup205和两个Nup93分子构成了CR的关键组分。这些改进后的电镜图揭示了对CR中不同Nup之间的界面的新见解。（生物谷 Bioon.com）

参考资料：

Xuechen Zhu et al. Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex. Science, 2022, doi:10.1126/science.abl8280.