超50款CGT药物上市，药物研发如何“借力”弯道超车？

从上世纪八十年代PCR被发明到1993年首个经FDA批准的PCR试剂盒投放市场，再到此后近30年时间里，科研者为解决实际应用中遇到的新问题，不断对这一技术进行优化，促使PCR经历了初代传统PCR、第二代实时荧光定量PCR（qPCR）、第三代数字化PCR（dPCR）的演变，成为了分子生物学基石技术之一。

三代PCR特点及适用场景

（图片来源：公开资料整理）

qPCR和dPCR都能够克服传统PCR在定量分析方面的不足。其中，qPCR是利用插入性染料或荧光探针，连续监测荧光信号出现的顺序和强弱变化，实现了PCR从定性到定量的飞跃。由于其特异性好、准确性高、操作简单、经济高效、动态范围很广等优点而成为众多应用的首选，包括抗体、疫苗、基因与细胞治疗的研发，也是最常用基因表达分析方法之一。

不过qPCR只能实现相对定量，需要用标准品生成一个标准曲线。而dPCR则是基于限制性稀释的概念，在每个液滴内进行PCR反应，再通过泊松统计学对每个液滴进行分析。这一技术本身就是绝对定量的，不需要做标准曲线。且dPCR更加精确，理论上能鉴别差异小于20%的拷贝数，更适合涉及定量的应用以及稀有或低拷贝数样品。

根据微反应单元的不同形式，dPCR可分为微板式、微滴式和芯片式等，其中微滴式dPCR（ddPCR）凭借技术和成本方面的优势逐渐获得青睐。其通过对包裹在离散的油包水乳化液滴中的核酸分子进行计数，提供了高度精确性和绝对的核酸定量，拥有极低的检测下限，无需统计Ct值，数据自动化分析，对PCR抑制物耐受性更高，适用于过程样品和最终药物产品的分析，降低了开发的复杂性，也使得在整个研发生产过程中使用ddPCR成为可能。

广泛应用，PCR助力CGT领域腾飞

近年来，随着超过50款基因与细胞疗法的获批上市以及众多候选管线的推进，CGT领域俨然已经处于高速发展阶段。而PCR技术作为分子生物学的基石级别技术，也已经被广泛用于CGT领域的识别和验证药物靶点、药物筛选、分子机制研究、体内外药效评估、药物检测等，几乎贯穿了CGT整个药物研发流程。

传统PCR需要利用凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测，本身无法定量，常被用于基础的测序、基因表达和分子克隆等。但传统PCR已经逐渐被qPCR和dPCR取代。而qPCR和dPCR在CGT领域的应用有诸多交叉的地方。

病毒载体分析

目前，细胞治疗与基因治疗的药物以病毒载体为主，常见的包括慢病毒（LV）、腺相关病毒（AAV）和重组腺相关病毒（rAAV）等。鉴于病毒载体的复杂性与特殊性，其关键质量属性的表征和测定至关重要。

其中，病毒滴度是衡量病毒数量和毒力的一个重要指标，也是评估以其为载体的细胞与基因疗法质量和效力的一个重要参数。检测病毒滴度的方法有很多，主要包括物理方法（透射电镜法、血凝法、qPCR、ELISA）和生物方法（病毒空斑试验、免疫荧光斑块）。相对而言，这些方法中qPCR由于操作简单、高效快速、性价比高等优点而成为最常用、最成熟的方法之一。

以AAV/rAAV载体为例，其特征序列鉴别、基因组滴度、价效-基因表达的质量属性均可以用PCR方法进行分析。qPCR仍是首选方法，不过由于其定量结果取决于扩增效率，会受到引物和探针设计、抑制剂浓度、模板中的二级结构影响，检测中可能存在很大的变异性，且qPCR需要建立标准曲线，在精确性和可重复性上有待提升。

随着研究的开展，利用dPCR来精确测量不同的目标逐渐成为一个趋势。ddPCR可直接绝对定量，无需标准曲线，能够可靠地区分连续的载体拷贝，对AAV介导的基因疗法开发过程中使用的污染物不敏感，稳定性更高而批次间差异更小，在基于病毒的基因疗法的开发全流程中，ddPCR能够被应用在质粒质量检测、病毒滴度测定、质量控制等多个关键环节中，包括中间产品及最终产品的定量分析。值得一提的是，ddPCR技术在受监管的生物分析中应用也越来越频繁，监管部门已经逐步接受基于这一方法所提交的数据。

CAR-T细胞检测

在细胞疗法方面，CAR-T疗法率先实现了上市的突破，CAR-T疗法的安全性和有效性也成为了研究者和监管机构评估一款产品的基础。而准确的载体拷贝数（VCN）是评估的重点，FDA颁布《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》草案中指出“VCN转基因整合可能改变细胞基因的表达，并导致致瘤性”，这需要精确测定VCN以确保其在安全有效的范围内，而传统的VCN测定方法就是qPCR，其能够对大量细胞药品进行VCN测定。

当需要更加精确的方法时，ddPCR就成了不二之选，其高精确度能够检测到小的载体拷贝数变化。《CYTOTHERAPY》上曾有文章证明了ddPCR技术可以被用于CAR转基因以及VCN的绝对定量，且准确性和可重复性均高于qPCR。

输注的CAR-T细胞的增殖能力和持久性决定了其在体内的抗肿瘤效果，而释放的细胞因子和脱靶毒性则会引发副作用，因而需要对其进行监测。常用的监测输注CAR-T细胞的方法包括流式细胞术和使用CAR特异性引物的qPCR，后者主要是从基因组水平检测CAR载体，提供有关扩增和动力学的基因组水平信息。

qPCR和ddPCR都能够通过定量检测全血细胞提取的DNA中CAR的拷贝数来反映CAR-T细胞在体内的增殖，进而可以检测CAR-T在体内的药代动力学。已有Fehse等人在试验中利用ddPCR法精确定量分析接受Yescarta治疗的患者中低至0.01%的CD19 CAR-T细胞。而更低的检测下限也意味着更精确的CAR-T细胞体内存续监测，减少了因患者个体差异而带来的测定不准确性，由此得出的数据更利于后续在药物开发及临床试验方面的改进，对于研发疗效和安全性更佳的细胞疗法而言具有重要意义。

mRNA中的定量分析

除了在病毒载体和细胞疗法方面的应用，PCR技术也被广泛应用于mRNA药物的研发中。2022年的美国药典（USP）发布的“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案曾推荐了mRNA原料药的鉴定、含量、完整性、纯度和安全性等质量属性的评估方法。

虽然qPCR也被广泛用于mRNA所编码的RNA序列、残余DNA模板等方面的检测，但这一技术会受到mRNA标准品不稳定易降解和反转录过程效率难以控制的影响，导致准确性降低。而在上述指南中，USP推荐使用ddPCR对mRNA定量分析。ddPCR能够实现在单个微滴中逆转录以及cDNA扩增，再经过荧光检测、计数、泊松分布计算出mRNA的含量，不会受到反转录效率影响，且其无需制定标准曲线，更适用于不稳定的药物的检测。

污染物检测

无论是细胞疗法还是基因疗法，产品的纯度（如宿主残留DNA、质粒残留DNA）和安全性（如支原体检测）是最终质量保障的两大要点。FDA和我国第三部《药典》均指出每剂量中残余外源性DNA应低于100pg，ddPCR能够更加敏感准确测定出其含量，以确保产品符合标准。加之ddPCR对抑制剂耐受性更高，更适用于检测复杂、稀有的样本中的残留DNA。

在支原体检测上，qPCR是目前最常用的方法之一，其在支原体16S rRNA基因保守区设计引物可以通过检测支原体DNA来检查细胞中有无支原体污染，在灵敏度、特异性和检测速度上均具有优势。ddPCR也可以用于支原体检测，在这些优势之上，ddPCR还可以在支原体检测期间计算基因组拷贝与集落形成单位的比率而无需标准曲线，更常用于像生物制品这种基质复杂样品的检测。

针对像CAR-T细胞疗法这种基于病毒转染的产品，可能会存在发生重组形成复制型慢病毒（RCL）或复制型逆转录病毒（RCR）的风险，从而RCL/RCR检测在细胞药物的研发生产过程中也至关重要。PCR/qPCR法曾被《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》提到可以用于RCL/RCR检测，不过qPCR法存在检测下限（约为10copies）、引物探针特异性较低的问题。因而结合新兴技术ddPCR来更加精确检测RCL/RCR具有重要意义，也有望满足“0检出”的安全性需求。

另外，在残留DNA检测方面，由于残留DNA可能会具有传染性或致癌性，且会影响后续药物治疗，产生一定风险，因而需要对外源性DNA含量进行检测，经典的方法包括qPCR、阈值法、杂交法。但随着产品生产与质量控制要求的提高，qPCR存在检测结果与真实值差异较大的问题。监管部门曾提出生物制剂中存在的残留DNA需在100pg/剂量以下，根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量，这也意味着检测方法需要高精度和高准确性。ddPCR更高的灵敏度、重复性、准确性也为残留DNA检测提供了新的方法。针对当下主流的HEK293、E.coli、CHO细胞、Vero细胞，均已有基于ddPCR检测方法的商品化残留DNA定量试剂盒，不易受到复杂基质和工艺中间体样品的干扰，符合监管部门要求的同时又兼高性价比的优势。

技术研发，成就未来

工欲善其事必先利其器，技术的迭代升级推动着科学研究的发展。从一代PCR到三代PCR，每代PCR各有优势，均有适用的场景。同时，PCR技术的应用也促使CGT领域药物研发全流程变得更加便捷化、精确化、标准化，为CGT领域药物研发保驾护航。（来源：医麦客）

参考资料：

1.Digital polymerase chain reaction strategies for accurate and precise detection of vector copy number in chimeric antigen receptor T-cell products

2.https://www.bio-rad.com/

3.《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》