Sci Adv：理蜡块“开口讲空间故事”，上海交通大学杨朝勇等开发Decoder-FFPE-seq把灵敏度拉高2.6倍

空间转录组学（ST）揭示天然组织背景内的细胞结构和分子网络，推进对生物学、器官发生和疾病病理学的见解。在肿瘤学中，ST提供前所未有的分辨率来解构肿瘤微环境（TME），揭示其细胞组成、空间组织和相互作用，阐明肿瘤起始、进展和治疗耐药背后的分子机制。

将这些见解转化为临床实践需要与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本兼容的ST平台，后者是病理档案的基础。这些庞大储存库提供无与伦比的机会将空间分子景观与注释临床结局联系起来，从而驱动精准肿瘤学。然而，FFPE样本内的RNA在固定和长期储存期间经历交联、片段化和降解。这些改变诱导聚腺苷酸[poly(A)]尾丢失和核酸与生物分子之间的加合物形成，破坏基于poly(T)的RNA捕获和酶促反应，妨碍ST应用于存档标本。

FFPE样本中有效的ST分析需要四个关键能力：（i）特异性回收全基因组转录本，涵盖mRNAs、调控RNAs甚至致病RNAs，同时排除基因组DNA和高度丰富（约80%）但信息有限的核糖体RNAs（rRNAs）的干扰，以重建准确的空间基因表达和共调控网络；（ii）灵敏检测存档组织中低丰度或严重降解的转录本，以鉴定生物标志物和稀有细胞类型，从而促进对生理和病理机制的更深理解；（iii）单细胞分辨率以解析结构细节和细胞-细胞相互作用；（iv）可及性、可采用性和可重复性，以便在研究社区中广泛使用并可行性用于大规模纵向队列研究。尽管有几项开创性探索，满足这些要求的FFPE兼容ST方法选择有限。

基于成像的ST方法如多重荧光原位杂交（FISH）/测序平台[例如10x Genomics的Xenium、NanoString的CosMx和Vizgen的MERSCOPE]在FFPE组织中实现亚细胞分辨率和高灵敏度，但其有限通量、劳动密集型工作流程和成像信号漂移妨碍转录组范围的可扩展性。

基于阵列的ST平台，包括商业系统如10x Genomics的Visium CytAssist_FFPE和Visium HD，以及新兴方法如Stereo-seq V2和Patho-DBiT，通过实现全转录组原位捕获和空间条形码标记绕过成像系统的通量上限。然而，每种都保留内在约束：Visium仅提供mRNA分析，表现出适度灵敏度并使用户锁定于封闭源代码试剂盒。Stereo-seq V2和Patho-DBiT虽覆盖总RNAs，但遭受使用随机引物或原位聚腺苷酸化对基因组DNAs和rRNAs的混杂捕获。

这损害其灵敏度和特异性，特别是对低丰度和严重降解转录本的检测。此外，Patho-DBiT受组织变形和跨微通道交叉污染风险阻碍，而Stereo-seq V2需要复杂位置解码，两者都限制可及性。

图1.解码器- ffpe -seq在小鼠组织中的工作流程和性能（摘自Science Advances）

作者先前开发了Decoder-seq，使用含有高密度确定性空间条形码的树枝状DNA玻片（Decoder玻片）用于新鲜冷冻（FF）组织中的高灵敏度ST分析。在此，作者报告适配FFPE组织的Decoder-seq（Decoder-FFPE-seq），其将RNA片段转换为可编码和可扩增的DNA探针，并利用高条形码密度Decoder玻片上的印迹辅助空间条形码标记。

Decoder-FFPE-seq纳入几个关键进展，以广泛可及的方式实现存档组织的灵敏、高分辨率、全转录组分析。第一，作者拓宽ST范围以包括更广泛RNA种类，以深入理解空间生物学。设计多个分裂探针文库用于特异性无偏回收全mRNAs、关键调控长非编码RNAs（lncRNAs）和致病RNAs，有效最小化对DNAs和rRNAs的非特异性捕获。

第二，作者在Decoder玻片上实施印迹辅助空间条形码标记以显著改善基因检测灵敏度。印迹辅助策略在独立玻璃玻片上分离组织预处理和探针标记，从而防止条形码DNA丢失和潜在污染，并充分利用Decoder玻片的高条形码容量。

第三，作者进一步提高Decoder玻片的空间分辨率，使Decoder-FFPE-seq实现单细胞分辨率（8-μm斑点）用于转录和细胞景观的高清映射。第四，作者建立易于遵循的工作流程及详细方案，涵盖组织预处理、探针靶向和印迹辅助空间条形码标记，以最大化RNA回收同时确保可重复性和可及性。连同Decoder玻片的公开可用制造过程，Decoder-FFPE-seq确保研究社区的广泛可及性和可采用性。

凭借这些创新，Decoder-FFPE-seq在小鼠脑和存档口腔鳞状细胞癌（OSCC）样本中相较于现有ST平台（例如10-μm bin Stereo-seq V2或8-μm bin Visium HD）在单细胞分辨率下实现超过2.6倍的灵敏度增加。作者有效检测低丰度非感觉G蛋白偶联受体（GPCRs），揭示潜在定义Gpr83表达斑点细胞身份的生物学有意义共定位模式，并解析精细小鼠组织结构内的稀疏抑制性神经元亚型。

作者的方法在空间分析保存长达6至20年的挑战性人类组织转录组中展示稳健性能，即使在分布值在200核苷酸（nt）（DV200）仅为17%的20年OSCC中也是如此。在具有间质侵袭性肿瘤的OSCC样本中，8-μm斑点Decoder-FFPE-seq可靠解析异型增生-间质界面和肿瘤亚簇，鉴定上皮–间充质转化（EMT）相关特征以在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、宫颈鳞状细胞癌（CESC）和食管鳞状细胞癌（ESCA）患者中提供预后价值。

通过mRNA-lncRNA和宿主mRNA-致病RNA的空间共分析，Decoder-FFPE-seq揭示调节肿瘤进展的相互作用网络。应用于OSCC样本的免疫检查点阻断（ICB）试验揭示跨病理反应组的空间TME异质性，并追踪化疗免疫治疗前后关键细胞和分子区室的时空动态。

总之，Decoder-FFPE-seq为存档组织中单细胞分辨率、全基因组ST分析提供强大且可及的平台，为基础生物学和转化研究开辟有前景的途径。

参考消息：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ady5085